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Title Page

Abstract

Contents

General introduction 9

General Characteristics of phytochromes 9

Molecular natures of phytochrome protein 11

Nuclear/cytoplasmic partitioning of PHYB and PHYA 12

Various approaches in phytochrome signaling 13

Chapter 1 : FIN5 positively regulates Far-Red light responses in Arabidopsis thaliana 17

1-1. Introduction 18

1-2. Results 20

Isolation of a FR light-specific long hypocotyl mutant, fin5-1 20

Genetic analyses of fin5-1 21

Physiological analyses of fin5-1 mutant 22

Differential effects of fin5-1 on the light-dependent expression of various genes 23

1-3. Discussion 25

1-4. Materials and Methods 29

Plant materials 29

Light sources 29

Hypocotyl length measurements 30

Screening of mutants insensitive to continuous far-red light 30

Genetic mapping 31

Measurement of anthocyanin contents 32

FR light-preconditioned blocking of greening experiment 32

Flowering time measurement 32

RNA gel blot analysis 33

Chapter 2 : Molecular characterizations of RCD1 family in Arabidopsis thaliana found from yeast two hybrid screening 42

2-1. Introduction 43

2-2. Results 45

Isolation of PIM1 by yeast two-hybrid screening 45

The amino acid sequence of the PIMl and other two clones are highly conserved in higher eukaryotes 46

PIM1 and one of the two homologous genes bind to both phytochrome A and B 47

In vitro binding assay of PIM1 and AtRCD1 with PHYA or PHYB 48

Yeast two hybrid assays using deleted cDNA fragments of PIM1 and AtRCD1 49

mRNA expression patterns of PIM1 and AtRCD1 50

T-DNA knock out lines screening and transgenic lines analyses of RCD1 family in Arabidopsis. 51

Localization analyses of PIM1 and AtRCD1 53

2-3. Discussion 54

2-4. Materials and Methods 58

Yeast two-hybrid assay 58

In vitro transcription/translation of phytochromes A, - B and PIM1 or AtRCD1 59

In vitro protein binding assay 60

Competitive RT-PCR analyses 61

Localization experiments 62

References 82

국문요약(Abstract in Korean) 92

Curriculum Vitae 96

초록보기

 빛은 지구뿐 아니라 식물의 가장 중요한 에너지원이다. 특히 식물에 있어서는 에너지원으로서의 기능뿐 아니라 발아 시기 부터 개화 시기 까지 의 식물 전체 생활상을 조절하는 중요한 요소이다. 식물에는 3 종류의 광 수용체가 있다고 알려져 있다. 첫째는 phytochrome이고 두 번째는 Blue/UV-A 광 수용체, 세 번째는 아직 밝혀지지 않은 UV-B 광 수용체이다. phytochrome은 빛의 적색과 극적 색을 인식하는 수용체로서 식물에는 작은 유전자 군으로 존재하며 연구가 가장 잘 된 수용체이다. Blue/UV-A 광 수용체는 두 종류로 나뉘는데 cryptochrome은 식물의 de-etiolation과 개화 시기를 조절하며 photopropin은 광 굴절성과 기공 세포의 opening/closing을 조절한다. UV-B 광 수용체는 아직까지 규명되지 많은 수용체이다.

애기장대에는 총 5 종류의 phytochrome이 존재하며 이 중 phyA와 phyB가 가장 잘 연구되어 있다. PHYA는 단백질이 빛에 쉽게 부서지는 Type I으로 분류되며 PHYB~PHYE는 단백질이 빛 신호에 강하게 존재하는 Type II phytochrome 으로 분류된다. 애기장대의 다섯 종류의 phytochrome중 phyA는 극적색광에 특이적으로 작용하는 독특한 수용체이다. FR-HIR (High Irradiance Response) 조건에서 phyA가 조절하는 생리작용으로는 hypocotyl 길이 성장의 억제, 떡잎 발달 조절, hook 펴짐의 조절 등이며 seedling시기에서의 이러한 생리 변화를 de-etiolation이라 한다. FR-HIR 조건에서 phyA가 조절하는 다른 생리 작용으로는 색소체 축적을 유도하며 떡잎에 엽록체가 축적되지 않는 blocking of greening process 을 유도한다. FR-HIR 조건에서 자란 식물체의 떡잎은 엽록체 축적이 일어나지 않아 백화 현상을 보인다.phyA의 또 다른 중요한 기능은 VLFR(Very Low Fluence Response)을 유도하는 유일한 수용체라는 점이다. phyA는 VLFR 조건하에서 식물의 발아 유도 및 빛에 의해 조절되는 다양한 유전자의 발현을 유도한다.

phyB의 경우 R-HIR 및 LFR 조건에서 다양한 식물 생리 및 유전자들을 조절한다. R-HIR 조건에서는 hypocoty1 길이 성장 저해, 떡잎의 발달 유도, hook expansion등 de-etiolation을 유도하며 LFR 조건에서는 빛에 의해 조절 받는 다양한 유전자들의 발현 및 발현 억제를 조절한다. 또한 vegetative 시기에서는 다른 Type II phytochromes과 상호 연계하여 shade avoidance 반응을 유도하며 개화 시기를 살펴 보면 phyB 돌연변이체의 경우 LD (Long Day) 조건하에서 개화시기가 느리다.

phytochrome에 의해 조절되는 다양한 반응들의 기작을 알기 위해 지난 50여년 동안 많은 연구가 수행되어 왔다. 생화학적 분석에서는 phytochrome 단백질의 분자적 성격을 규명하는 연구가 깊이 있게 진행되어 왔다. 전통적인 유전학적 접근법에서는 phytochrome 신호 전달 체계에 이상이 있는 돌연변이체 및 당 유전자들의 분자 수준의 연구를 통해 상당히 유용한 접근법이라는 점이 증명 되었다. 또한 최근에 이용되고 있는 yeast two hybrid 기법을 이용한 연구에서는 phytochrome 의 신호 전달 체계에 중요한 기능을 하는 새로운 유전자들이 찾아지고 기능 규명이 이루어져 왔다.

본 논문의 1 과에서는 전통적인 유전학적 접근법을 통하여 phyA 신호 전달 체계에 중요한 기능을 하는 fin5-1 돌연변이체에 대한 기능 분석을 기술하고 있다. fin5-1 은 T-DNA 형질전환체들에서 찾아진 돌연변이체로 약간의 우성 형질을 보이고 있다. 유전체상에서 fin5-1의 위치는 chromosome 4번에 위치한다. fin5-1 근처에는 이 전에 보고된 far1 및 laf1 돌연변이체가 존재하는데 fin5-1은 두 돌연변이체의 중간에 위치한다. fin5-1 은 FR-HIR 조건하에서 다양한 표현형을 보여주고 있다. 특히 hypocoty1 길이 성장이 대조군 보다 길며 떡잎의 발달이 완전하지 않고 gravitropism에 문제가 있는 것을 보이고 있다. 분자 생물학적 분석에서도 표현형과 유사한 경향성을 보여주고 있다. 즉 극적광에 의해 유도되는 다양한 유전자들의 발현에 이상이 있는데 특히 fin5-1 돌연변이체 내에서 CAB 과 PsbS 유전자 발현이 서로 다른 조절 앙상을 보이는 것은 이전까지는 보고되지 않은 사실이다.

2 과에서는 reverse genetic 기법인 yeast two hybrid 를 이용해서 빛 신호 전달 체계에 중요한 기능을 담당할 새로운 유전자 발굴에 대해 기술하고 있다. yeast two hybrid screening 을 통해서는 아직 기능이 규명되지 않은 두 정류의 유전자를 찾았다. 그 중 하나는 eukaryote 에 폭 넓게 존재하는 RCD1 유전자 군에 속하는 유전자이고 다른 하나는 TPR domain을 가지고 있는 유전자이다. 본 논문에서는 두 유전자중 RCD1 유전자와 상동성을 가지는 PIM1 (Phytochrome Interacting Molecule) 과 애기 장대에서 당 유전자와 상동성을 가지는 AtRCD1, AtRCD2 에 대한 분자 유전학적 연구에 대해 기술하고 있다. 분자 생물학적 접근에서는 PIM1 및 AtRCD1, AtRCD2 가 단백질 수준에서의 상동성은 높지만 식물 발달에 서로 다른 기능을 할 것이란 예측을 할 수 있다. PIM1 및 AtRCD1 은 PHYA 단백질과 interaction 을 하지만 AtRCD2 는 반응하지 않는다. 또한 RNA gel blot 분석에서는 PIM1 과 AtRCD1 의 발현 양상이 서로 다른 것으로 나타났다. 이상의 분석과 더불어 실제 당 유전자들이 식물체 내에서 수행하는 기능들을 알기 위해 당 유전자들이 knock out 된 돌연변이체들의 screening을 수행하였다. 결과로는 PIM1 은 한 개의 knock out line을 찾을 수 있었고 AtRCD1 은 3 개, AtRCD2 는 2 개의 서로 독립적인 knock out 돌연변이체들을 찾을 수 있었다. 당 유전자들의 개별 돌연변이체 및 double, triple 돌연변이체에 대한 연구를 수행함으로써 RCD1 family 유전자들의 식물체 내에서의 기능을 새롭게 규명할 수 있을 것이다.

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