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Contents

Abbreviations 4

국문초록 7

Abstract 9

Introduction 11

Materials and methods 16

Cell culture 16

Antibodies and reagents 17

Recombinant DNA constructs 17

Penetratin-ICAM-1 peptides 19

Cell transfection and establishment of stable cell lines 20

Immunofluorescence staining and confocal imaging 20

Flow cytometric analysis 21

Immunoprecipitation and western blotting 22

Live cell, time-lapse confocal and EPI fluorescence imaging 23

Scanning electron microscopy 24

FRAP measurements 25

Under-static adhesion and transmigration assays 26

Under-flow adhesion and migration assays 27

Results 29

The distribution and dynamic movements of ICAM-1 on transfected COS-7 cells 29

Intracellular domain of ICAM-1 involves in microvillar organizationand F-actin formation 37

RKIKK motif in cytoplasmic domain is critical for the spatialorganization and dynamic behavior of ICAM-1 during leukocyteadhesion and transmigration 47

Cell-permeant peptides comprising the RKIKK motif attenuate ICAM-1-redistribution during leukocyte adhesion and migration and inhibitTEM of leukocytes 61

Discussion 67

References 73

List of publications 78

List of Figure

Figure 1A. Characterization of COS-7 cell lines that weretransfected with cDNAs containing wild-type ICAM-1 or ICAM-1lacking cytoplasmic domain 31

Figure 1B and C. Characterization and expression analysis of COS-7 cell lines and primary HUVECs that were transfected with cDNAscontaining wild-type ICAM-1 or ICAM-1 lacking cytoplasmic domain 32

Figure 1D and E. Time-lapse live cell confocal microscopic analysisof ICAM-1-GFP proteins expressed on COS-7 cells 33

Figure 2A. WT-ICAM-1 was colocalized with F-actin in microvilli while DCTD-ICAM-1 did not 35

Figure 2B and C. ICAM-1 lacking cytoplasmic domain revealedreduced colocalization with ERM family 36

Figure 3A. Overexpression of ICAM-1 induced F-actin formationand microvillar elongation 38

Figure 3B. WT-ICAM-1 induced microvillar elongation in COS-7 cells 39

Figure 3C. Phospho-ERM was localized on the tip of growing microvilli in COS-7 cells expressing WT-IC1_GFP 41

Figure 4. Activation of HUVECs by TNF-α induces ICAM-1-mediated microvilli and F-actin 42

Figure 5A. DN-Ezrin_RFP dramatically reduced microvilliformation in that cells expressing wild-type ICAM-1_GFP 43

Figure 5B and C. PECAM-1 was not directly involved in the microvilli formation, but instead it was clustered on the microvilli of COS-7 cells overexpressing WT-Ezrin or WT-ICAM-1 44

Figure 6. ICAM-1_GFP signal recovery after photobleaching 46

Figure 7A and B. Schematic representation of C-terminally mutated ICAM-1-GFP constructs and their expression on the surface of cells 49

Figure 7C. Localization of various constructs of ICAM-1-GFP withF-actin in COS-7 cells 50

Figure 8. Dynamic movement of ICAM-1 clusters on the surface ofCOS-7 wt-IC1_GFP cells 52

Figure 9A and B. RKIKK motif was critical for ICAM-1-mediated ring-shaped membrane projection upon binding to LFA-1 on leukocytes 54

Figure 9C and D 55

Figure 10A. Leukocyte binding to and migration on monolayers of COS-7 cells that express wt-IC1 in a parallel wall flow chamber 57

Figure 10B. Leukocyte binding to and migration on monolayers of COS-7 cells that express IC1△RKIKK in a parallel wall flow chamber 58

Figure 11A and B. Adhesion of human PBLs on COS-7 cells expressing wild-type and mutants ICAM-1 was performed in the presence or absence of SDF-1α (A) or CBR-LFA-1/2 mAb (B) underthe static flow condition 59

Figure 11C. RKIKK motif is important for leukocyte migration butnot for firm adhesion 60

Figure 12A. Effects of penetratin-ICAM-1 peptides on the leukocyte adhesion on and transmigration through HUVECs under the staticflow condition 64

Figure 12B and C. Effects of penetratin-ICAM-1 peptides on thedynamic distribution of ICAM-1 (B), leukocytes adhesion on andtransmigration (C) through endothelial cells in a parallel wall flow chamber 65

Figure 13. Proposed model of leukocyte adhesion on andtransmigration through endothelial cells 66

초록보기

세포간 부착분자-1 (ICAM-1)은 백혈구 세포의 혈관 내 내피세포에 대한 부착을 증가시켜서 내피세포를 통한 백혈구 세포의 이동을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나 백혈구 세포가 혈관 낸 내피세포를 통해 이동하는 과정이 어떻게 일어나는 지에 대해서는 아직 분자적 기전이 밝혀져 있지 않다. 따라서 T 림프구 세포를 이용하여 림프구 세포가 내피세포에 부착하고 이동할 때 ICAM-1 분자의 세포질 영역이 T 림프구 세포의 부착과 이동과정에서 어떻게 역할 하는지를 알아보기 위해서 ICAM-1의 세포질 영역의 일부 또는 전부가 결여도니 돌연변이 ICAM-1을 제작하였다. 살아있는 세포의 실시간 분자영상을 통해서 wild-type ICAM-1이 세포막의 미세돌기에 군집되어 발현하면서 미세돌기 형성을 유도하고, 세포막 위해서 연속하여 역동적으로 움직이는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 세포질 영역을 전부 결여 시킨 돌연변이 ICAM-1의 경우, 세포막의 미세돌기에 군집되어 발현하지 못하고 세포 표면 전체에 균일하게 퍼져서 발현되는 것을 관찰할 수 있었으며, wild-type ICAM-1과는 달리 세포골격 단백질인 액틴과 같은 세포 내 위치에서 발현되지 않는 것을 볼 수 있었다. 세포질 영역의 어떤 아미노산 서열이 ICAM-1의 세포막 미세돌기 발현에 영향을 주는 지를 알아보기 위해서 여러 부위의 세포질 영역을 결여 시킨 돌연변이 ICAM-1을 제작하여 관찰할 결과, 알파-액티닌 결합 사이트로 알려져 있는 507RKIKK511 아미노산 서열이 없으면 세포막의 미세돌기에 ICAM-1이 군집되어 발현하지 못하고, 액틴 세포 골격단백질과 같은 세포 내 위치에서 발현하지 못하며, 액틴과의 결합을 조절하는 linker 단백질로 알려져 있는 ERM 단백질 패밀리와도 같은 세포 내 위치에서 발현하지 못하는 것을 볼 수 있었다. 더 나아가서 ICAM-1의 세포막 미세돌기 발현에 중요한 역할을 하는 507RKIKK511 아미노산 서열이 T 림프구 세포의 부착과 이동에서도 중요한 역할을 하는 지를 알아본 결과, 507RKIKK511 아미노산 서열이 없는 돌연변이 ICAM-1의 경우, T 림프구 세포의 이동을 현저하게 감소시켰다. 결론적으로, ICAM-1의 세포질 영역 중 알파-액티닌 결합 사이트로 알려져 있는 507RKIKK511 아미노산 서열은 ICAM-1에 의한 세포막 미세돌기 형성, 액틴 세포골격단백질과의 결합 및 움직임 조절, ICAM-1의 세포 외 위상학적 발현 등에 영향을 주며, 이 ICAM-1의 세포막 위상학적 변이가 내피세포를 통한 T 림프구 세포의 이동에 중요한 영향을 준다.

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