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표제지

국문요약

목차

서론 9

대상 및 방법 14

1. 대상 14

2. 방법 14

(1) 세포유전학적 분석 14

(2) RNA 추출 및 complementary DNA (cDNA) 합성 15

(3) Dual priming oligonucleotide (DPO) 적용 15

(4) Multiplex RT-PCR 실시 16

(5) 예후인자 분석의 기준 17

결과 30

1. 예비검사 30

2. 대상군의 특성 30

3. Multiplex RT-PCR 로 검출된 융합전사 31

4. 세포유전학적 검사로 관찰된 염색체 이상 32

5. Multiplex RT-PCR 과 세포유전학적 분석과의 비교 32

6. Multiplex RT-PCR 에서 검출된 융합전사의 예후인자로서의 의의 및 세포유전학적 분석 결과와의 비교 34

고찰 57

결론 76

참고문헌 77

Abstract 88

감사의 글 91

List of Tables

Table 1. Target genes and GenBank accession numbers 22

Table 2. Chromosomal aberrations, corresponding fusion transcripts, and the size of the amplified products in acute myeloid leukemia patients in this study 23

Table 3. Chromosomal aberrations and corresponding fusion transcripts, and the size of the amplified products in acute lymphoblastic leukemia patients in this study 26

Table 4. Criteria for prognostic stratification in acute myeloid leukemia in this study (rearranged from the table in Blood Rev 2004;18:115-36.) 28

Table 5. Criteria for prognostic stratification in acute lymphoblastic leukemia or biphenotypic acute leukemia in this study (rearranged from the table in Blood Rev 2004;18:115-36.) 29

Table 6. Results of multiplex RT-PCR of cryopreserved samples from 32 patients with acute leukemia and comparison with their karyotypes 42

Table 7. General characteristics of patients enrolled in this study 44

Table 8. Results of multiplex RT-PCR and cytogenetic analysis of 77. patients with acute myeloid leukemia 45

Table 9. Results of multiplex RT-PCR and cytogenetic analysis of 44. patients with acute lymphoblastic leukemia or biphenotypic acute leukemia 49

Table 10. Frequency of genetic rearrangements in patients with acute leukemia detected by multiplex RT-PCR or conventional cytogenetic analysis 52

Table 11. Results of multiplex RT-PCR and cytogenetic analysis in the fourteen cases for which the two methods revealed discordant findings 53

Table 12. Comparison of risk group assignment by molecular screening and by cytogenetic analysis in acute leukemia 56

List of Figures

Fig. 1. Schematic representation of the amplification process using long conventional primer and DPO. Upper, middle, and lower pairs indicate perfect match, mismatch at 3’ end, and mismatch at 5’ end, respectively (from Nucleic Acids Res 2007;35:e40.). 20

Fig. 2. Ethidium bromide-stained agarose gel of PCR fragments from the dilutions of recombinant plasmid DNA carrying CBFβ-MYH11 fusion transcript. Lane M, 100bp ladder; lane 1, 2×105copies/mL; lane 2, 2×10²copies/mL; lane 3, 2×10-¹copies/mL; lane 4, 1×10-¹ copies/mL; lane 5, 1×10-²copies/mL; lane 6; 1×10-3copies/μL; lane 7, water control...(이미지참조) 21

Fig. 3. Flow diagram illustrating the multiplex RT-PCR system in this study. (A) Agarose gel with all negative PCR. (B) Agarose gel with AML1-ETO positive PCR (591bp band) in lane 1. Note that there is no need to do a nested PCR or split-out PCR to determine the translocation. (C) Agarose gel with MLL-AF6 positive PCR (374bp band) in lane 3. A single... 27

Fig. 4. Examples of fusion transcripts detected by the multiplex RT-PCR system. The red arrowheads indicate positive PCR bands, and the blue pointers do internal control. Lane M, 100bp ladder; Numbers, reaction tubes of multiplex RT-PCR system; lane N, DW as a negative control. (A) AML1-ETO fusion transcript (case No. 75). (B) PML-RARα bcr 1... 40

Fig. 5. Distribution of genetic risk group assignment by molecular screening and cytogenetic analysis in acute myeloid leukemia. Twenty-five patients (32.5%) were classified in the favorable prognostic category by molecular screening. 54

Fig. 6. Distribution of genetic risk group assignment by molecular screening and cytogenetic analysis in acute lymphoblastic leukemia or biphenotypic acute leukemia. Fifteen patients (34.1%) were classified in the adverse prognostic category by molecular screening. 55

초록보기

배경 : 급성백혈병에서 염색체 전좌를 비롯한 세포유전학적 변화를 검출하는 것은 진단과 예후추정에 필수적이다. 고전적인 세포유전학적 분석은 전좌 뿐 아니라 수적이상이나 결실과 같은 모든 염색체 이상을 포괄적으로 선별할 수 있는 장점이 있다. 그러나 시간과 노동력이 많이 소요되고, 잠재적 전좌를 발견하기 어렵다는 단점이 있다. 최근 다중 역전사중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction, multiplex RT-PCR)이 어느 정도의 포괄성을 지니면서도 세포유전학적 분석의 단점을 극복하는 방법으로 부각되고 있다. 이에 저자들은 비용-효과적, 임상적으로 가장 합리적이라고 생각되는 전좌의 조합을 선택하여 multiplex RT-PCR 시스템을 고안하였다. 그리고 이를 사용하여 급성백혈병의 분자생물학적 선별을 시도하고, 예후인자 평가의 관점에서 세포유전학적 분석과 비교하고자 하였다.

재료 및 방법 : 2006 년 11 월부터 2007 년 7 월까지 121 명의 연속적인 급성백혈병 환자를 대상으로 multiplex RT-PCR 시스템(Seegene, Korea)을 이용해 총 16 종의 융합전사에 대한 분자생물학적 선별을 시도하였다. 이들 융합전사는 BCR-ABL, PML-RARα, PLZF-RARα, AML1-ETO, CBFβ-MYH11, DEK-CAN, E2A-PBX1, TEL-AML1, 그리고 각종 MLL 재배열(MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-AF10, MLL-ELL, MLL-ENL, MLL-AF17, MLL-PTD) 등이다. 세포유전학적 분석은 표준적인 GTL-banding 기법을 이용하였다. 불일치하는 경우는 형광제자리부합법(fluorescence in situ hybridization, FISH)이나 전통적 단일 RT-PCR 로 확인하였다.

결과 : 대상군에서 성인은 89 명(73.6%), 소아는 32 명(26.4%)이었다. 급성골수성백혈병(acute myeloid leukemia, AML)이 77 명(63.6%), 양표현형급성백혈병 7 명을 포함한 급성림프모구백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL)이 44 명(36.4%)이었다. 세포유전학적 분석은 118 명(97.5%)에서 가능하였다. Multiplex RT-PCR 에서는 60 명(49.6%)에서 모두 64 예의 융합전사가 검출되었다. AML 에서는 AML1-ETO 14 예, PML-RARα 8 예, CBFβ-MYH11 3 예, DEK-CAN 1 예, BCR-ABL 1 예, MLL-PTD 6 예, MLL-AF6 4 예, MLL-AF9 3 예, MLL-ELL 1 예 등이었다. 그리고 ALL 에서는 BCR-ABL 12 예, TEL AML1 4 예, E2A-PBX1 2 예, MLL-AF4 3 예, MLL-AF9 1 예, MLL-PTD 1 예 등이었다. 세포유전학적 분석에서는 82 명(69.5%)에서 염색체이상이 관찰되었다. 두 검사의 일치율은 88.3%였고, 14 명의 환자에서 일치하지 않는 결과를 보였다. 이중 7 명은 세포 유전학적 분석에서 관찰되지 않았던 염색체 이상이 multiplex RT-PCR 에서 검출된 경우였다. 그 항목은 TEL-AML1 3 예, MLL-AF9 2 예, MLL-AF6 1 예, PML-RARα 1 예 등으로 잠재적 전좌의 빈도는 5.8%이었다. 나머지 7 명은 세포유전학적으로 관찰이 불가능한 MLL-PTD 가 검출되었다. 반면, 각각 inv(16), t(4;11), FISH 에서 MLL 재배열이 관찰되었던 3 명의 환자에서는 multiplex RT-PCR 에서 해당 융합전사가 검출되지 않았다. 분자생물학적 선별을 통해 AML 환자군에서는 32.5%의 예후양호군을, ALL 환자군에서는 34.1%의 예후불량군을 우선적으로 선별할 수 있었다. Multiplex RT-PCR 로 예후군이 결정된 경우 예후인자 분류의 기준으로서 두 검사법의 일치율은 89.5%이었으나, AML 과 ALL 각각 3 명의 환자에서는 분자생물학적 선별을 통해 세포유전학적 검사와는 전혀 다른 예후인자 수준을 확인할 수 있었다.

결론 : 급성백혈병에서 multiplex RT-PCR 을 이용한 분자생물학적 선별은 유전적 이상에 대한 신속한 정보 제공으로 적절한 치료방침 선택에 도움을 줄 수 있었다. 또한 세포유전학적 검사로 관찰이 어려운 잠재적 전좌의 검출에도 유용하였다. 그러나 multiplex RT-PCR 이 세포유전학적 분석을 완전히 대체할 수는 없으므로, 급성백혈병의 진단시 두 검사를 상호보완적으로 이용하면 유전적 변이를 보다 신속하고 보다 많이 검출할 수 있을 것으로 기대한다.

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