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표제지

초록

목차

약어 10

1. 서론 11

1.1. Nonribosomal peptide synthetase (NRPS) 11

1.2. Siderophore 13

1.3. 본 연구의 목적 14

2. 재료 및 실험 방법 16

2.1. 균주 및 배양 조건 16

2.2. sp970의 도메인 구조 분석 16

2.3. 펩타이드의 분리와 분석 17

2.4. 펩타이드의 정제 18

2.5. 질량 분석 18

2.6. 화학적 작용기 분석 19

2.7. desferri-siderophore로 전환 20

3. 결과 및 토의 22

3.1. sp970 의 도메인 구조의 예측 22

3.2. sp970 주위 유전자 클러스터 23

3.3. Siderophore 분석: ESI-MS, Universal CAS assay, Csaky test 28

3.4. MSn fragmentation 분석(이미지참조) 34

3.5. 화학적 작용기 분석 및 Arginine 의 확인 42

3.6. 펩타이드의 예상 구조 47

4. 결론 52

5. 참고문헌 53

ABSTRACT 59

표목차

표 3.1. sp970 의 각 모듈의 A 도메인의 기질특이성 포켓의 코드 및... 26

표 3.2. 화학적 작용기 분석 종류, 방법 및 검출 작용기 44

표 3.3. 유사한 siderophore 의 분자량 및 구조 50

그림목차

그림 1.1. NRPS 의 구조 (ㄱ) NRPS 의 일반적인 모듈과 도메인 구성... 15

그림 3.1. sp970 의 모듈 및 도메인 구조와 다른 균주에서 발견된 유사한... 25

그림 3.2. sp970 주위의 유전자 유사성을 바탕으로 정리한 클러스터 27

그림 3.3. 펩타이드의 질량분석 결과 및 확대 스펙트럼 30

그림 3.4. Fe3+ 이온과 Ga3+ 이온과 결합한 펩타이드 스펙트럼(이미지참조) 31

그림 3.5. CAS assay 의 원리와 펩타이드의 분석 결과 (순서대로... 32

그림 3.6. Csaky test 의 원리와 분리된 펩타이드의 Csaky test 결과 33

그림 3.7. 펩타이드의 m/z 673 이온의 MS/MS 스펙트럼 38

그림 3.8. m/z 673 이온의 MS/MS 스펙트럼에서 나타난 fragment... 39

그림 3.9. m/z 645, 659, 673, 687 이온의 MS/MS 스펙트럼 비교 40

그림 3.10. m/z 201, 215, 229, 243 이온의 MS³ 스펙트럼 비교 41

그림 3.11. desferri form 의 펩타이드의 acetylation1 과 acetylation2 45

그림 3.12. Arginine 표준 시료와 펩타이드의 m/z 157 이온의... 46

그림 3.13. 2 가지 펩타이드 예상 구조의 제안 51

초록보기

Nonribosomal peptide synthetase (NRPS)는 여러 개의 모듈로 이루어진 거대한 효소로서 세포 내에서 펩타이드를 합성하는 역할을 한다. 이렇게 생산된 펩타이드를 nonribosomal peptide 라고 하며 항생제, 항암제, 면역 억제제, siderophore 등의 다양한 생물학적 활성을 보인다.

방선균은 의약학적으로 다양하게 이용되는 2 차 대사 산물을 풍부하게 생산하는데 그 중 Streptomyces puecetius 는 항암제인 독소루비신을 생산하는 것으로 중요한 의미를 가지는 박테리아이다. Streptomyces peucetius ATCC 27952 의 유전체 정보는 수 년 전에 해독되었고 2 차 대사 산물을 생산할 것으로 예상되는 몇 개의 유전자가 발견되었다.

본 연구에서는 그 중 sp970 이라고 잠정적으로 이름 붙여진 NRPS 유전자를 선정하였다. 이 유전자의 주위 ORF 를 탐색하여 gene cluster 를 정리하였고 이것을 바탕으로 sP970 의 생산물인 펩타이드의 역할이 siderophore 일 것이라고 추측되었다.

Sp970 의 모듈과 도메인 구조는 NRPS 데이터베이스로부터 homology search 를 통해서 4 개의 모듈을 가진 것으로 예측되었다.

Sp970 의 생산물 펩타이드를 분리하여 universal CAS assay 를 통해 siderophore 임을 확인하였고, Csaky test 를 통해서 hydroxamate 작용기를 가진 siderophore 임을 확인하였다. 분리된 펩타이드를 ESI-MS 로 분석하여 분자량이 672.3 Da 으로 확인되었고 644.3, 658.3, 672.3, 686.3Da 의 여러 형태가 존재함을 확인할 수 있었다. 14Da 차이의 원인에 대해서 분리 과정에서의 산에 의한 분해를 확인해 보았으나 산에 의한 영향은 없는 것으로 확인되었고 생산될 때부터 여러 형태로 생산되는 것으로 예상되었다. 펩타이드의 tandem mass spectrometry 분석을 통해서 hfOrn-Arg-hOrn-hfOrn 과 neutral modification 으로 이루어진 펩타이드의 구조를 제시하였다.

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