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표제지

목차

I. 연구사 10

1. 생균제 (Probiotics) 10

1) 생균제의 정의 10

2) 축산용 생균제 10

2. 생균제용 미생물의 특징 13

1) 유산균 (Lactic acid bacteria)의 특징 및 기능 13

2) 비피더스균(Bifidobacterium)의 특징 및 기능 14

3) 바실러스(Bacillus)의 특징 및 기능 15

4) 효모 및 곰팡이(Yeast & Fungi)의 특징 및 기능 16

5) 광합성 세균(Photosynthetic bacteria)의 특징 및 기능 17

3. 생균제의 품질관리 19

1) 유통생균제 현황 19

2) 생균제의 품질분석 19

3) 미생물의 분리 동정 방법 20

4) 생균제의 분자생물학적인 평가방법 21

5) Real Time PCR을 이용한 미생물 정량·정성분석 22

4. 인용문헌 24

II. 생균제 품질관리를 위한 미생물 선택배지 개발 30

ABSTRACT 30

I. 서론 31

II. 재료 및 방법 32

1. 사용균주 32

2. 균주 배양 및 선택배지 32

3. 선택배지별 미생물 발육 실험 33

4. 유산균 선택배지 제조 33

III. 결과 및 고찰 35

1. 유산균의 배지별 성상 35

2. 고초균의 배지별 성상 36

3. 효모 및 곰팡이의 배지별 성상 36

4. 유산균 선택배지에서의 성상 37

5. 미생물별 최적 선택배지 38

IV. 요약 40

V. 인용문헌 41

III. 생균제의 저장성 유지 및 개선방안 43

ABSTRACT 43

I. 서론 44

II. 재료 및 방법 45

1. 음수 생균제 저장성 평가 45

2. 규산염제 및 다공성 물질의 첨가수준에 따른 생균제 저장성 평가 46

III. 결과 및 고찰 47

1. 액상생균제 저장성 평가 47

2. 규산염제 및 다공성물질의 첨가수준에 따른 생균제 저장성 평가 50

IV. 요약 52

V. 인용문헌 53

IV. 분자생물학적인 방법을 이용한 유산균 정량·정성분석 54

ABSTRACT 54

I. 서론 55

II. 재료 및 방법 56

1. 사용균주 56

2. 시약 및 기기 56

3. oligonucleotide primer and probe 57

4. 균주 배양 57

5. DNA 추출 57

6. Lactobacillus genus primer를 사용한 based-PCR 57

7. TA cloning 및 Transformation 58

8. Plasmid DNA Purification 59

9. Cloning 된 plasmid DNA copy number에 따른 detection limit 59

10. SYBR Green 1 방법을 이용한 Real time PCR 60

11. Probe 방법을 이용한 Real time PCR 61

III. 결과 및 고찰 62

1. Lactobacillus genus primer를 사용한 based-PCR 62

2. Lactobacillus reuteri 16S-23S rRNA intergenic species region의 cloning 63

3. Gene cloning 된 plasmid DNA copy number에 따른 검출한계 67

4. Real time PCR system을 이용한 Lactobacilli 정성·정량 분석 71

IV. 요약 75

V. 인용문헌 76

V. 총괄요약 78

감사의 글 80

표목차

I. 연구사 7

Table1. MicroorganismsusedforProbiotics 11

Table2. Classification of Photosynthetic bacteria 17

Table3. Microorganisms in koreananimal feeding system 18

Table4. Classification of microorganism 21

II. 생균제 품질관리를 위한 미생물 선택배지 개발 7

Table1. Bacterial strains used for the experiment 32

Table2. Medium used for the the experiment 33

Table3. Composition of MCS medium 34

Table4. Composition growth of Lacti cacid bacteria 35

Table5. Composition growth of Bacillus species 36

Table6. Composition growth of Yeast & Fungi 37

Table7. Composition growth of different microbes on MCS medium 38

III. 생균제의 저장성 유지 및 개선방안 7

Table1. Bacterial strains used in the experiment 45

Table2. Viable count of B.subtilis by different treatments and periods 50

Table3. Viable count of L.plantarum by different treatments and periods 51

IV. 분자생물학적인 방법을 이용한 유산균 정량·정성분석 7

Table1. Primer sets used in this experiment 57

Table2. Cloning vectors used for the cloning in the experiment 59

Table3. Quantitative analysis of Lactobacillus species in probiotics using Real time PCR by the method of SYBR Green 1 72

Table4. Quantitative analysis of Lactobacillus species in probiotics using Real time PCR by Probe method 74

그림목차

I. 연구사 8

Fig1. Real Time PCR of SYBR Green 1 method 23

Fig2. Real Time PCR of Probe method 23

II. 생균제 품질관리를 위한 미생물 선택배지 개발 8

Fig1. Bacterial colonies on BCP medium 39

Fig2. Bacterial colonies on MCS medium 39

Fig3. Bacterial colonies on MYP medium 39

Fig4. Bacterial colonies on YGC medium 39

III. 생균제의 저장성 유지 및 개선방안 8

Fig1. The effect of temperature and incubated period on the survival rate of L.plantarum 47

Fig2. The effect of temperature and incubated period on the survival rate of L.reuteri 47

Fig3. The effect of temperature and incubated period on the survival rate of P.acidilactici 48

Fig4. The effect of temperature and incubated period on the survival rate of P.cerevisiae 48

Fig5. The effect of temperature and incubated period on the survival rate of B.lentus 49

Fig6. The effect of temperature and culture period on the survivalrate of S.cerevisiae 49

IV. 분자생물학적인 방법을 이용한 유산균 정량·정성분석 8

Fig1. PCR amplification of Lactobacillus genomic DNA with various specific primer sests 62

Fig2. Schematic procedure(I) for construction of recombinant DNA 63

Fig3. Schematic procedure(II) for construction of recombinant DNA 64

Fig4. Identification of plasmid DNA by agarose gel electrophoresis 64

Fig5. Insert check from the insert and vector site 65

Fig6. BLAST Search from sequence producing significant align 66

Fig7. Standard curves for the copy number of plasmid DNA containing L.reuteri 16S-23S rRNA intergenic species region gene by SYBR Green 1 method 67

Fig8. Real time PCR sensitivity with the copy number of purified plasmid DNA 10-fold serially diluted 68

Fig9. Standard curves for the copy number of plasmid DNA containing L.reuteri 16S-23S rRNA intergenic species gene by Probe method 69

Fig10. Realtime PCR sensitivity with the copy numberofpurified plasmid DNA 10-fold serially diluted 70

Fig11. Detection ofLactobacilliin probiotics using Realtime PCR system in SYBR Green 1 method 71

Fig12. Detection ofLactobacilliin probiotics using Realtime PCR system in Probe method 73

초록보기

식품공전 상 유산균수를 측정하기 위해서 BCP 배지를 사용하도록 하고 있으나 BCP 배지에서 유산균 뿐 만 아니라 고초균, 효모 등도 생육함을 알 수 있었다. 또한 한국단미사료협회, 농협사료연구소, 사료공정 등에서 사용하는 유산균 선택배지에서 유산균 뿐 만 아니라 고초균, 효모 등도 생육함을 알 수 있었다. 반면에 MCS 배지를 유산균 선택배지로 제조하여 미생물의 생육을 관찰 한 결과 바실러스, 효모의 생육이 불가능함을 알 수 있었다. 실험 결과 혼합생균제의 경우 유산균 선택배지로는 MCS 배지를 사용하는 것이 적합하며, 바실러스 선택배지로는 MYP 배지를 사용하는 것이 효율적인 것으로 판단되었으며, 효모 곰팡이 선택배지로는 YGC배지를 사용하는 것이 선택적으로 미생물 검정을 하는데 효율적일 것으로 판단된다.

생균제의 저장성을 높이기 위한 기초자료로써 음수생균제의 온도에 따른 기간별 생존율을 평가하였다. 유산간균인 L.palntarum KCTC3104는 5℃에서 8일까지 90%의 생존률을 보였으며, L.reuteri KCTC3594는 5℃에서 5일까지 100%의 생존률을 보였다. 유산구균인 Pediococcus acidilactici KCTC3101은 5℃와 15℃에서 6일까지 100%의 생존률을 보였으며, Pediococcus cerevisiae KCTC3509는 5℃에서 6일까지 85% 생존률을 보였다. 고초균인 B.lentus KCTC7904는 5℃에서 4일까지 94% 생존률을 보였으며, 효모인 Saccharomycess cerevisiae KCTC7904는 5℃에서 5일까지 95% 생존률을 보였다. 규산염제 및 다공성 물질들을 이용한 고체발효생균제의 저장성을 증진시키기 위하여 규산염제 및 다공성 물질을 첨가수준별로 첨가하고 40%수준으로 종균을 접종하여 제조하였으며, 진공 포장하여 보관하여 생존율을 평가하였다. B.subtilis의 생균수 측정 결과 활성탄 0.1%, 0.3%첨가구에서 100% 생존률을 보였으며, 활성탄 1.0%첨가구에서 98% 생존률을 보였으며, L.plantarum의 생균수 측정 결과 활성탄 0.1%첨가구에서 96% 생존률을 보였으며, 활성탄 0.3%첨가구에서 97% 생존률을 보였고, 활성탄 1.0% 첨가구에서 98% 생존률을 보였다. 이 결과 활성탄의 작은 세공과 흡착성능이 뛰어나 미생물이 침투된 것으로 사료된다. 실험 결과를 미루어 보아 음수생균제는 5℃ 정도의 온도에 보관하고 가급적이면 빠른 시일안에 사용 하는 것 이 효과적이며, 고체발효생균제 저장성을 증진시키기 위해서는 활성탄과 같이 미세세공과 흡착성능이 뛰어난 규산염제를 사용하는 것이 효과적 일 것 이라 사료된다.

Real Time PCR을 일반 PCR 과 같이 2개의 primer 을 이용하는 원리는 같으나 형광물질이 화학적으로 결합하여 실시간으로 형광 광도를 측정하여 여러 가지 기지시료로부터 표준곡선을 도출하고 이 곡선으로부터 미지시료의 정량을 할 수 있는 장점을 가지고 있다. SYBR Green 1 방법을 이용한 16S-23S rRNA intergenic species region gene cloning 된 palsmid DNA를 108 copy number로부터 10² copy number에 이르기 까지 단계적으로 희석하여 Real time PCR을 실행하여 얻은 결과를 통해 Ct값에 따른 plasmid DNA copy number의 표준곡선을 얻었으며 이때의 Slope는 -3.346이었고, Y절편은 33.18, R² 값은 0.993으로 나타났다. 108 copy number 이상에서는 초기 DNA양이 많아서 PCR inhibitor로 작용하여 검출곡선을 나타낼 수 없었다. 생균제에 대하여 preculture 하지 않고 DNA를 추출한 16개의 제품에서 증폭이 일어났으며, 이때의 Ct 값은 11.06~18.12으로 나타났다. 생균수 측정 결과 값과 log copies값이 다소차이를 보였다. 최정필(2005)의 보고에 의하면 PCR inhibitor와 primer의 dimer형성에 의한 conventional method와 차이가 난다는 보고와 같은 결과를 나타내었다. Probe 방법을 이용한 16S-23S rRNA intergenic species region gene cloning 된 palsmid DNA를 10³copy number로부터 1010 copy number에 이르기 까지 단계적으로 희석하여 Real time PCR을 실행하여 얻은 결과를 통해 Ct값에 따른 plasmid DNA copy number의 표준곡선을 얻었으며 이때의 Slope는 -3.321이었고, Y절편은 39.10, R² 값은 0.995로 나타났다. 1010 copy number 이상에서는 초기 DNA양이 많아서 PCR inhibitor로 작용하여 검출곡선을 나타낼 수 없었다. 생균제에 대하여 preculture 하지 않고 DNA를 추출한 16개의 제품에서 증폭이 일어났으며, 이때의 Ct 값은 16.74~22.11로 나타났다. 생균수 측정 결과 값과 log copies값이 다소차이를 보였다. 최정필(2005)의 보고에 의하면 PCR inhibitor와 primer의 dimer형성에 의한 conventional method와 차이가 난다는 보고와 같은 결과를 나타내었다.

본 연구 결과로 생균제의 품질관리를 위한 유산균 선택배지로써 MCS배지를 개발하였으며, 생균제 저장성 증진방안으로 고체 발효생균제 제조시 다공성, 흡착능력이 뛰어난 활성탄을 첨가함으로써 저장성을 높일 수 있었으며, Real time PCR을 이용한 미생물의 신속검출과 정량·정성 분석을 할 수 있었다.

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