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초록

목차

Ⅰ. 서론 12

Ⅱ. 실험재료 및 방법 15

1. 시료 및 DNA 추출 15

2. PCR 15

3. 16s rDNA library 제작 및 염기서열 분석 17

4. 계통수 분석 17

5. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 18

6. 배양 의존적 방법 18

6.1. 시료 18

6.2. 평판배양 18

6.3. PCR과 염기서열 분석 및 계통수 분석 18

6.4. Protease와 Urease 활성 측정 18

Ⅲ. 결과 20

1. 배양 비의존적 방법에 의해 발효홍어에 서식하는 미생물 다양성 의 분석 20

1.1. 16S rDNA library 분석 20

1.2. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis에 의한 분석 28

1.3. 배양 비의존적 방법에 의해 발효홍어로부터 동정된 균주들의 계통수 분석 30

2. 배양 의존적 방법에 의해 발효홍어에 서식하는 미생물 다양성의 분석 32

2.1. 도말평판법에 의해 형성된 집락 분석 32

2.2. 도말평판법에 의해 발효홍어로부터 동정된 균주들의 계통수 분석 39

2.3. 도말평판법에 의해 발효홍어로부터 분리된 균주들의 Protease 활성 및 Urease 활성 41

Ⅳ. 고찰 45

Ⅴ. 결론 49

Ⅵ. 참고 문헌 51

Abstract 53

List of Tables

Table 1. Nucleotide sequences of primers used in this study 16

Table 2. List of identified bacteria from the determination of DNA sequences from 16S rDNA fragment library. 27

Table 3. List of identified bacteria from the determination of DNA sequences for the 16S rDNA fragment from the colony PCR. 38

Table 4. Protease and urease activity in bacteria isolated from fermented Skate ray. 44

Table 5. List of bacteria detected in fermented Skate ray using two different approaches. 48

List of Figures

Fig. 1. Nucleotide sequences obtained from analysis of PCR amplified 16S rDNA fragment library. Underlines denote 338F and 518R primers used to amplify 16S rDNA fragments. Universal M13 Forward primer was used to determine the DNA sequence. 25

Fig. 2. Alignment of homologous sequence to identify the query DNA sequence obtained from PCR amplified 16S rDNA fragment using BLAST search. Uncultured bacterium clone 054E11.b 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (EU837945.1). 26

Fig. 3. DGGE analysis of 16S rDNA fragments by PCR amplified from the library using 338FGC and 518R primer set. Numbers represent individual clones obtained from 16S rDNA fragment library. C denotes the PCR products from fermented Skate ray... 29

Fig. 4. Cluster analysis of the profiles obtained from the 16S rDNA fragment sequences. 31

Fig. 5. Nucleotide sequences obtained from analysis of amplified 16S rDNA fragment by colony PCR. Underlines denote 518R primers used to amplify 16S rDNA fragments. Primer 338F was used to determine the nucleotide sequence. 36

Fig. 6. Alignment of homologous sequence to identify the query DNA sequence obtained from 16S rDNA fragment by colony PCR amplified using BLAST search. Colony PCR was performed for the colonies formed on MRS, PCA, and MacConkey agar plates after... 37

Fig. 7. Cluster analysis of the profiles obtained from the 16S rDNA fragment sequences using colony PCR for the colonies formed on various plates. 40

Fig. 8. (a) Protease activity was detected by growing on the skim milk plate for the colonies isolated from fermented Skate ray. (b) Urease activity for the colonies isolated from fermented Skate ray was detected by growing on the Christensen urea plate. 43

초록보기

자연계의 서식처에서 특정한 미생물이 증식하는데 필요한 조건을 실험실에서 선별적인 증식배양방법을 통해 충족시키기 어렵다. 지금까지 자연계에 존재하는 박테리아 중 0.1-10% 정도만이 실험실에서 분리되어 그 특성이 규명되었다고 알려져 있다. 따라서 생태계에 존재하는 미생물들을 집락 (colony)을 형성시켜 순수 배양을 하는 배양 의존적 방법 (culture-dependent)을 통해 수행된 미생물 연구는 원천적으로 뚜렷한 한계를 갖고 있다. 그러나 환경에 존재하는 미생물을 확인하기 위해 리보솜 RNA (rRNA) 유전자 서열을 분석하는 배양 비의존적 방법 (culture-independent)이 개발되어 배양 의존적 방법의 한계점을 보완해 주고 있다.

본 연구는 홍어회에 존재하는 미생물 균총의 다양성을 분석하기 위해 배양의존적인 방법과 배양 비의존적인 방법들을 동시에 사용하여 그 결과를 비교하였다.

홍어회에 존재하는 세균의 다양성을 규명하고자 홍어회를 PBS 완충용액에 현탁시켰다. LB 한천배지와 MRS 한천배지에 현탁액을 도말하여 단일 집락이 형성되도록 하였다. 중합효소 연쇄반응으로 단일 집락의 16S rDNA를 증폭하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLAST 데이터베이스와 비교하여 단일 집락들을 동정하였다. 또한 마쇄시킨 발효홍어 (홍어회)의 현탁액으로부터 전체 염색체 DNA를 분리한 후 이를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응에 의해 16S rDNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 HincII를 처리한 pUC18에 T4 DNA ligase를 처리하여 연결시킨 후 대장균에 형질전환시켜 16S rDNA 라이브러리를 제조하였다. 제조한 라이브러리로부터 플라스미드를 분리한 후 플라스미드 안에 있는 16S rDNA의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 BLAST 데이터베이스와 비교하여 동정하였다.

배양 의존적 방법에 의해 한천배지에서 형성된 집락을 분석한 결과, Pseudomonas sp. KC-EP-S13, Salmonella enterica subsp. Enterica servoar typhimurium str.14028S, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi strain SRDF10, uncultured bacterium clone R4J3M4-H2, Psychrobacter sp. HTGH24, uncultured bacterium clone LaYa5a-70, uncultured Leuconostoc sp. clone TKL42, Staphylococcus equorum strain SIP12, Psychrobacter sp. J466, uncultured bacterium clone nbw709f07c1, Staphylococcus sp. DHHS4, uncultured bacterium clone OKHOTSK-Bac-B38, uncultured bacterium clone PDTRI1OCT44 등이 동정되었다.

PCR에 의해 증폭된 16S rDNA 서열 분석을 하는 배양 비의존적 방법에 의해 발효홍어 (홍어회)에 존재하는 박테리아들을 분석한 결과 uncultured bacterium clone 054E11.b가 57.1%의 빈도로 가장 많이 존재하였으며, 이밖에 uncultured bacterium clone PDTRI1OCT054, uncultured bacterium clone 13/4/10H, uncultured bacterium clone nbt229e07, Adelie penguin guano bacterium 97, uncultured bacterium clone 004F02.b, uncultured bacterium clone 005F01.b, uncultured bacterium clone R2B18H, uncultured bacterium clone 001H10.g, Serpens flexibilis strain ATCC 29606, Psychrobacter sp. J466 등이 동정되었다.

배양 의존적 방법과 비의존적인 방법을 이용하여 동정하였을 때 Psychrobacter sp. J466만이 두 가지 방법에서 모두 검출이 된 반면에, 나머지 박테리아들의 분포도는 실험 방법에 따라 완전히 상이하였다.

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