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표제지

(국문초록)

목차

I. 서언 13

II. 연구사 16

1. Probiotics의 역사 16

2. Probiotics의 조건 16

3. 담즙산염 가수분해 효소(Bile Salt Hydrolase) 17

4. Bsh에 의한 혈중 cholesterol 저하효과 17

III. 재료 및 방법 19

1. 사용 균주 및 보존 19

2. 사용배지 및 배양 19

3. bile salt hydrolase A, B, C 유전자의 증폭 19

4. bshA, B, C 유전자의 클로닝 21

5. bshA, B, C 유전자의 대량발현 21

6. 발현된 재조합 BshA, B, C의 정제 22

7. 기질특이성 조사 22

8. 재조합 복합담즙산염 가수분해효소의 활성에 미치는 반응조건 조사 24

9. 재조합 Bsh 유전자의 분석 24

IV. 결과 및 고찰 25

1. L. johnsonii PF01 균주로부터 복합담즙산염 가수분해효소 유전자의 클로닝 25

2. bshA, B, C의 대량발현 30

3. 발현된 재조합 Bsh의 정제 32

4. 재조합 Bsh의 기질 특이성 34

5. 재조합 Bsh의 온도 및 pH에 대한 특성 37

6. bsh 유전자의 분석 42

7. bsh 유전자의 아미노산서열 분석 46

V. 고찰 48

참고문헌 50

(Abstract) 54

List of Tables

Table 1. Oligonucleotide primer's sequences used in this study 20

Table 2. PCR conditions for bsh gene amplification 20

Table 3. Blie acids of human bile used for this study 23

List of Figures

Figure 1. The synthesis and circulation of bile acids. 14

Figure 2. Chemical structure of bile acids. 14

Figure 3. Reaction catalyzed by Bsh enzymes. 17

Figure 4. Isolation of chromosomal DNA from L. johnsonii PF01. 26

Figure 5. Purification and restriction enzymes digestion of bsh genes. 27

Figure 6. Restriction enzyme digestion of plasmid DNA extracted from E. coli DH5α transformant. 28

Figure 7. Selection of Bsh-positive transformants. 29

Figure 8. Expression of Bsh in E. coli. 31

Figure 9. Purification of the recombinant Bsh Enzymes. 33

Figure 10. Substrate specificity of the recombinant Bsh enzymes. 36

Figure 11. Effect of temperature on the Bsh activity of from recombinant E. coli. 39

Figure 12. Effect of pH on the Bsh activity of from recombinant E. coli. 41

Figure 13. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the bshA from L. johnsonii PF01. 43

Figure 14. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the bshB from L. johnsonii PF01. 44

Figure 15. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the bshC from L. johnsonii PF01. 45

Figure 16. Alignment of Bsh from L. johnsonii PF01. 47

초록보기

유산균은 장내유해균 억제작용 및 정장작용, 혈중 콜레스테롤 감소기능, 항암작용, 면역증강 작용, 유당불내증완화 작용 등 인간과 가축에 직접 관여하는 유익한 미생물로서 마음놓고 섭취할 수 있는 안전한 미생물이다. 특히 Lactobacillus johnsonii PF01 균주는 선행연구를 통해 담즙산 분해능력이 우수하고 세 종류의 복합담즙산염 가수분해효소(bile salt hydrolase) 유전자를 가지고 있는 것으로 확인되었다. L. johnsonii PF01 유래 Bile Salt Hydrolase의 활성 및 기질특이성 조사를 위해 bsh A, B, C gene을 증폭하고 각각의 유전자를 발현벡터 pET21b에 클로닝하였다. 발현숙주인 Escherichia coli BLR(DE3)에 도입한 후 최종적으로 얻어진 형질전환 균주에서 0.1mM isopropylthiogalactopyranoside(IPTG)를 이용하여 Bsh의 발현을 유도하였고 발현된 Bsh를 정제하여 효소특성 및 기질특이성을 조사한 결과 세 종류의 Bsh 모두 활성을 보였으며 BshA는 tauroconjugated bile salts를 BshC는 glycoconjugated bile salts를 가수분해 하는 것으로 나타났다. Bsh의 최적활성 온도를 조사한 결과 BshA는 최적 온도가 55℃이었고 70℃의 고온에서도 최대 활성의 90% 정도의 활성을 나타내었으며, BshB는 BshA 보다 조금 높은 60℃에서 최고 활성을 나타내었다. BshC의 경우는 보다 높은 70℃에서 최적 활성을 나타내었고 80℃의 고온에서도 90%정도의 높은 활성을 보여 뛰어난 내열성을 나타내었다. Bsh의 최적 pH를 조사한 결과 BshA, B, C 모두 pH 4.5~5.0에서 최대의 효소 활성을 나타내는 약 알칼리성 효소라는 것을 알 수 있었다.

클로닝한 bsh 유전자의 염기서열을 분석한 결과 bshA, B, C 모두 하나의 open reading frame (ORF)임을 확인하였고 bshA는 981개의 염기로서 326개의 아미노산으로 구성되어 있었고 bshB는 951개의 염기로서 316개의 아미노산, bshC는 978개의 염기와 325개의 아미노산으로 구성되어 있었다. 재조합 bsh 유전자의 아미노산서열을 분석한 결과 BshA, B, C 모두 C, D, N, N, R의 다섯가지 active site와 FGRNXD, AGLNF, VLTNXP, GXGXGXXGXPGD과 같은 4개의 보존서열 또한 코드되어 있는 것을 확인하였다.

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