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표제지

목차

I. 서론 7

II. 재료 및 방법 12

1. 실험 재료, 시약 및 기기 12

1) 실험 재료 12

2) 시약 12

3) 기기 14

2. 실험 방법 15

1) 렉틴의 분리 및 정제 15

2) 렉틴 활성 실험 16

3) 렉틴의 생화학적 특성 17

4) 면역기능 증강효과 19

III. 결과 22

1. 렉틴의 분리 및 정제 22

1) Crude 렉틴의 분리 22

2) DEAE Sephadex A-50 column chromatography에 의한 정제 22

3) Sephadex G-200 column chromatography에 의해 정제 22

2. 렉틴 활성 실험 26

1) 적혈구 및 림프구 응집력 시험 26

2) pH의 영향 26

3) 온도의 영향 26

4) 금속 이온의 영향 26

3. 렉틴의 생화학적 특성 31

1) 당 특이성 31

2) 당 함량 분석 31

3) 단백질 동정 31

4. 반응 농도에 따른 사이토카인 유전자 발현 양상 35

5. 반응 시간에 따른 사이토카인 유전자 발현 양상 39

6. 반응 시간에 따른 사이토카인 생성량 46

IV. 고찰 48

V. 요약 55

참고문헌 57

Abstract 65

List of Tables

Table I. Purification of lectins from B. mori. 23

Table II. Specificity of BML on agglutination of erythrocytes from various species and rat splenic lymphocytes 27

Table III. Effect of pH on hemagglutinating activity of BML 28

Table IV. Effect of metal ions on hemagglutinating activity of BML 30

Table V. Inhibition of agglutination by sugars to the trypsinized rabbit erythrocytes with BML 32

Table VI. Kinetics of cytokine mRNA expressions in PBMC stimulated with BML for 1 hour and 20 hours 38

Table VII. Kinetics of cytokine mRNA expressions in PBMC stimulated with BML 45

Table VIII. Generation of IL-2 and IFNγ in culture supernatants by PBMC stimulated with BML 47

List of Figures

Fig. 1. Elution profile of B. mori crude lectins on DEAE Sephadex A-50 column (2.6×40 cm) chromatography. (Absorbance at 280 nm: - , Lectin activity: ●-●, Salt gradient: -----, flow rate: 24㎖/hr). 24

Fig. 2. Elution profile of 0.05M fraction from DEAE Sephadex A-50 column on Sephdex G-200 column (1.6×40 cm) chromatography (Absorbance at 280 ㎚: , lectin activity: ●-●, salt gradient: -----, flow rate: 24 ㎖/hr). 25

Fig. 3. Effect of temperature on hemagglutinating activity of BML 29

Fig. 4. Electrophoretic patterns of BML on SDS-ployacrylamide gel. 33

Fig. 5. Peptide fingerprints of band 'a' (a) and 'b' (b) obtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Band 'b' is truncated form of band 'a'. 34

Fig. 6. Dose dependent effect of BML on mRNA expression for various cytokines in PBMC cultured for 1 hour. The concentrations were represented as follows (the numbers mean optical densities): 36

Fig. 7. Dose dependent effects of mRNA expressions of BML on mRNA exprssion for various cytokines in PBMC cultured for 20 hours. The concentrations were represented as follows: (the numbers mean optical densities) 37

Fig. 8. PCR-assisted amplification of IL-1α (420 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IL-1α were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 40

Fig. 9. PCR-assisted amplification of IL-2 (395 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IL-2 were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 41

Fig. 10. PCR-assisted amplification of IL-6 (648 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IL-6 were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 42

Fig. 11. PCR-assisted amplification of IFNγ (438 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for IFNγ were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 43

Fig. 12. PCR-assisted amplification of TNFα (706 bp) mRNA from PBMC according to the increased reaction times. The bands for TNFα were detected from 1 to 72 hrs. after stimulation with BML. 44

초록보기

약용으로 사용되고 있는 곤충자원 중에서 누에나방 (Bombyx mori)을 대상으로 렉틴을 추출하였고, 생화학적 특성과 면역기능 증강효과를 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

한국산 누에나방 유충으로부터 ammonium sulfate로 단백질을 분리하고, DEAE Sephadex A-50 column과 Sephadex G-200 column을 이용하여 렉틴을 정제하였고, 이를 BML이라고 명명하였다.

BML은 사람의 적혈구에 대해서 응집현상을 나타내지 않았고, 토끼와 닭의 적혈구, Rat의 림프구 등에서 높은 응집현상을 나타냈다. pH에 대한 활성 효과는 강산과 강염기에서 억제되었고, 다른 렉틴보다 높은 열 안정성을 보여 90℃까지 렉틴의 활성이 관찰되었는데, 이는 17.16%의 당 함량으로 인한 결과로 사료되었다.

금속이온 중에서 특히 Ca²+과 Fe²+, Mn²+ 의존성을 나타낸 반면, Mg²+ 에 의해서는 억제되었다. 당에 의한 응집 저해 효과는 글루쿠론산에서 강한 특이성을 나타내었고, 헤파린에 의한 저해효과도 보였다. 또한 약 42 kDa과 52 kDa의 2개의 subunit으로 구성된 단백질로 추정되었다.

BML을 사용하여 PBMC를 대상으로 농도별, 시간별로 자극한 뒤, IL-1, IL-2, IL-6, IFNγ 및 TNFα 등 다섯 종류의 사이토카인 발현을 RT-PCR로 측정하였다.

흡광도 0.1을 적정농도로 결정하여 1, 4, 8, 24, 48 및 72 시간 동안 반응시킨 뒤 관찰된 사이토카인의 발현 양상을 확인한 결과, IL-1은 1시간에서 8시간까지, IL-2는 72시간까지, IL-6는 4시간에서 8시간까지, IFNγ는 48시간에서 72시간까지, 그리고 TNFα는 반응 1시간에서 8시간까지 강한 발현을 나타냈다. 이 실험에서 BML의 IL-2와 IFNγ의 유전자 발현양상은 다른 사이토카인과는 현저한 차이가 있음이 확인되었는데 시간이 경과할수록 band가 강해짐을 관찰되었다.

한편 사이토카인의 생성에 관한 실험은 ELISA 방법으로 실시하였다. IL-2의 경우, BML의 자극에 의해 서서히 증가해 48시간에서부터 다소 강한 생성량을 나타냈고, IFNγ은 반응 24시간부터 현저하게 증가하여 72시간에 최고의 생성량이 관찰되었다. 이 결과는 유전자 발현 양상과 거의 일치하였고 BML이 사이토카인 발현 및 생성능이 있음을 입증하여 면역 증강제로서의 가능성을 시사하는 것이었다.

추후 누에 렉틴의 아미노산 서열과 구조를 밝히는 작업 등, 생화학적 성질 구명에 관한 연구가 계속되어야 할 것이다.

참고문헌 (65건) : 자료제공( 네이버학술정보 )

참고문헌 목록에 대한 테이블로 번호, 참고문헌, 국회도서관 소장유무로 구성되어 있습니다.
번호 참고문헌 국회도서관 소장유무
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2 (1991) Occurrence of lectin in the silkgland of the silkworm, Bombyx mori. Develop. Growth & Differ. 33(4): 421-427. 미소장
3 Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. 네이버 미소장
4 The cytokine network 네이버 미소장
5 Identification of a Common Nucleotide Sequence in the 3′-Untranslated Region of mRNA Molecules Specifying Inflammatory Mediators 네이버 미소장
6 Musa acuminata (Del Monte banana) lectin is a fructose-binding lectin with cytokine-inducing activity 네이버 미소장
7 Isolation and Purification of Lectin from Phaseolus radiatus 네이버 미소장
8 (1986, a) Lectins. Review of Biochem. Biochem. Soc. Kor. 1: 371-382. 미소장
9 (1986, b) Studies on lectins from marine shells(Ⅲ): Screening of lectin-like agglutinins from marine shells. Arch. Pharm. Res. 9: 201-203. 미소장
10 (1980) Isolation, purification and characterization of phytohemagglutinating proteins from Korean natural products. Arch. Pharm. Res. 3: 31-36. 미소장
11 Studies on Lectins from Marine Shells(V) Isolation and Purification of Lectin from Tapes philippinarum 네이버 미소장
12 Purification and Immunochemical Studies on L-PHA Lectin 소장
13 Isolation and characterization of a novel lectin from the mushroom Armillaria luteo-virens 네이버 미소장
14 Lectin-carbohydrate interactions: different folds, common recognition principles. 네이버 미소장
15 What should be called a lectin? 네이버 미소장
16 (2004) Effects of ADL on cytokine gene expression from human peripheral blood mononuclear cells. M.A. Thesis. Yeungnam Univ: 1-33. 미소장
17 (1990) Biological and clinical aspects of interleukin 6., Immuol. Today 11: 443-449. 미소장
18 Anti-tumor Effect of Korean Mistletoe Extract Intensified with Mistletoe Lectin against Melanoma Cells in vitro and in vivo 소장
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20 Purification and properties of a D-galactose/N-acetyl-D-galactosamine-specific lectin from Erythrina cristagalli. 네이버 미소장
21 Effect of Mung Bean Lectin(MBL) on Cytokine Gene Expression from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells 소장
22 (1981) Lymphostimulation by PHA Lectins. J. of Natural Sciences. 183-191. 미소장
23 Studies on Lectins from Mushrooms(II) Screening of Bioactive Substance, Lectins, from Korean Wild Mushrooms 네이버 미소장
24 Immunomodulating Effect of the Lectin from Allomyrina dichotoma 소장
25 Characteristics and Cancerostatic Activity of the Starfish Lectin 소장
26 Effect of Asterina pectinifera Lectin on Cytokine Production 소장
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36 The lipopolysaccharide-binding protein participating in hemocyte nodule formation in the silkworm Bombyx mori is a novel member of the C-type lectin superfamily with two different tandem carbohydrate-recognition domains. 네이버 미소장
37 Purification and partial characterization of a lectin from the fresh leaves of Kalanchoe crenata (Andr.) haw 소장
38 Polypeptides of the tail fibres of bacteriophage T4. 네이버 미소장
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51 Massachusetts Proposes $1 Billion Plan 네이버 미소장
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53 Mistletoe lectins I, II and III induce the production of cytokines by cultured human monocytes 네이버 미소장
54 Purification and characterization of a lectin from the banana shrimp Fenneropenaeus merguiensis hemolymph. 네이버 미소장
55 Lectins as inducers of interferon-gamma production in human lymphocytes: lentil lectin is highly efficient. 네이버 미소장
56 (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Ana. Chem. 68(5): 850-858. 미소장
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59 Interleukin-2: Inception, Impact, and Implications 네이버 미소장
60 Purification and characterization of a natural lectin from the plasma of the shrimp Fenneropenaeus chinensis 네이버 미소장
61 Identification of a protein having hemagglutinating activity in the hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. 네이버 미소장
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63 Purification of a peptidoglycan recognition protein from hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. 네이버 미소장
64 Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding a transferrin homolog from Bombyx mori. 네이버 미소장
65 Bombyx mori transferrin: Genomic structure, expression and antimicrobial activity of recombinant protein 네이버 미소장

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