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표제지

목차

ABBREVIATIONS 6

Abstract 8

I. 緖論 10

II. 實驗材料 및 方法 12

1. 實驗材料 12

1) 藥材 12

2) 세포주 13

3) 試藥 및 器機 13

2. 方法 13

1) 試料製造 13

2) 세포주 배양 14

3) 세포생존율 측정 14

4) DAPI 염색 14

5) 세포 내 활성산소종(ROS) 생성의 측정 15

6) Western blot analysis 15

7) 통계처리 16

III. 實驗結果 17

1. Neuro-2A 세포에서 glucose 및 FBS 고갈에 의한 세포생존율의 변화 17

2. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 세포생존율의 변화에 미치는 영향 19

3. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 핵의 형태 변화에 미치는 영향 21

4. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 활성산소종의 생성에 미치는 영향 23

5. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 HO-1 단백질의 발현 변화에 미치는 영향 26

6. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 퍼옥시좀 구성단백질인 PMP70와 ACOX1의 발현 변화에 미치는 영향 28

7. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 SOD 단백질의 발현 변화에 미치는 영향 30

8. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 GPx 단백질의 발현 변화에 미치는 영향 32

9. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 catalase 단백질의 발현 변화에 미치는 영향 34

10. 淸離滋坎湯이 glucose 및 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸에서 PPARα 단백질의 발현 변화에 미치는 영향 36

IV. 考察 38

V. 結論 45

參考文獻 47

국문초록 55

List of Tables

Table 1. Prescription of Chunglijagam-tang 12

List of Figures

Figure 1. Cell viability of glucose and FBS deprivation condition on Neuro-2A cells. Cells were treated with a glucose (Glu) and FBS deprivation condition for several times. Cell viability was measured by MTT assay. Results were... 18

Figure 2. Treatment of CLJGT inhibited glucose and FBS deprivation-induced cell death in Neuro-2A cells. Cells were treated with the various concentrations of CLJGT and the cells were exposed to glucose (Glu) and FBS deprivation for 48 hr. Cell viability was... 20

Figure 3. Effect of CLJGT on glucose and FBS deprivation-induced cell death in Neuro-2A cells. Cells were treated with CLJGT and the cells were exposed to glucose and FBS deprivation for 48 hr and stained with DAPI. Then, cells were visualized under... 22

Figure 4. ROS generation on glucose and FBS deprivation-induced Neuro-2A cell death. Cells were incubated with the dye DCF-DA (5 μM) and the fluorescence intensity of more than 10,000 cells was analyzed using a flow cytometry. The data... 24

Figure 5. Scavenging effect of CLJGT on intracellular ROS in glucose and FBS deprivation-induced Neuro-2A cell death. Cells were treated with CLJGT and the cells were exposed to glucose (Glu) and FBS deprivation for 48 hr. Then, cells were incubated with the dye DCF-DA (5... 25

Figure 6. Effect of CLJGT on the expression change of HO-1 and HO-2 proteins by glucose and FBS deprivation in Neuro-2A cells. Cells were incubated in the glucose (Glu) and FBS deprivation media with 200 ㎍/㎖ CLJGT for 24 hr. Expression pattern of proteins was analyzed by Western... 27

Figure 7. Effect of CLJGT on the expression change of PMP70 and ACOX1 proteins by glucose and FBS deprivation in Neuro-2A cells. Cells were incubated in the glucose (Glu) and FBS deprivation media with 200 ㎍/㎖ CLJGT for 24 hr. Expression pattern of proteins was analyzed by Western... 29

Figure 8. Effect of CLJGT on the expression change of SOD-1 and SOD-2 proteins by glucose and FBS deprivation in Neuro-2A cells. Cells were incubated in the glucose (Glu) and FBS deprivation media with 200 ㎍/㎖ CLJGT for 24 hr. Expression pattern of proteins was analyzed by Western... 31

Figure 9. Effect of CLJGT on the expression change of GPx protein by glucose and FBS deprivation in Neuro-2A cells. Cells were incubated in the glucose (Glu) and FBS deprivation media with 200 ㎍/㎖ CLJGT for 24 hr. Expression pattern of proteins was analyzed by Western... 33

Figure 10. Effect of CLJGT on the expression change of catalase protein by glucose and FBS deprivation in Neuro-2A cells. Cells were incubated in the glucose (Glu) and FBS deprivation media with 200 ㎍/㎖ CLJGT for 24 hr. Expression pattern of proteins was analyzed by Western... 35

Figure 11. CLJGT up-regulates PPARα expression and prevents the glucose and FBS deprivation-induced cell death in Neuro-2A cells. Cells were incubated in the glucose (Glu) and FBS deprivation media with 200 ㎍/㎖ CLJGT in the absence or presence of Fenofibrate (20 μM) or GW6471 (10... 37

초록보기

본 연구에서는 허혈성 뇌질환 실험 모델로 Neuro-2A 세포에 glucose 및 FBS를 차단하여 세포사멸을 유도하고, 이때 淸離滋坎湯의 신경세포 사멸에 대한 보호효과와 세포 내 활성산소종의 생성 조절에 관여하는 퍼옥시좀 관련 단백질들의 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과 glucose 및 FBS를 각각 제거한 실험군보다 glucose 및 FBS 동시 고갈 실험군에서 유의하게 시간 의존적으로 세포생존율이 감소하였다. 그러나, 淸離滋坎湯은 glucose와 FBS 고갈에 의한 Neuro-2A 세포사멸을 농도의존적으로 보호하였다. 또한, Neuro-2A 세포에서 glucose와 FBS의 고갈은 시간 의존적인 활성산소의 생성 증가를 유도하였으나, 淸離滋坎湯 처리 시 세포 내 활성산소의 생성이 억제됨을 확인하였다. 특히, 淸離滋坎湯 처리 시 PMP70, ACOX1의 발현양이 증가하였으며, 퍼옥시좀내 항산화효소인 SOD-1, catalase 및 GPx 단백질의 발현양도 현저히 증가하였다. PPARa agonist인 fenofibrate 처리 시 淸離滋坎湯 처리군과 유사하게 PPARa의 발현이 증가하였으며 glucose와 FBS 고갈에 의한 세포사멸을 보호하였다. 반면, PPARa antagonist인 GW6471을 처리 시 淸離滋坎湯에 의한 PPARa 단백질의 발현 증가와 세포보호효과를 억제하였다. 따라서, 淸離滋坎湯은 PPARa의 발현 증가를 통해 퍼옥시좀의 수적증가를 유도하였으며, 또한 SOD-1, catalase 및 GPx 등 퍼옥시좀 관련 항산화 단백질의 발현 증가를 통해 glucose와 FBS 고갈에 따른 산화적 손상으로부터 Neuro-2A 세포를 보호하였다고 판단된다.

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