Title Page

Contents

ABBREVIATIONS 11

GENERAL INTRODUCTION 12

Chapter 1. Efficiency of Shoot Regeneration from Leaf, Stem, Petiole, and Petal Explants of Six Cultivars of Dendranthema grandiflorum 14

ABSTRACT 15

INTRODUCTION 16

MATERIALS AND METHODS 18

Plant materials 18

Shoot induction 20

Rooting and acclimatization 20

Experimental design and statistical analysis 21

RESULTS AND DISCUSSION 22

Shoot induction 22

Rooting and acclimatization 34

LITERATURE CITED 38

Chapter 2. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Dendranthema grandiflorum with GUS Gene 44

ABSTRACT 45

INTRODUCTION 46

MATERIALS AND METHODS 47

Plant materials, culture media and experimental conditions 47

Agrobacterium strain and culture for transformation 47

Antibiotics used in shoot regeneration and rooting 48

Agrobacterium-mediated transformation 49

GUS assay 50

Genomic DNA isolation and polymerase chain reaction (PCR) analysis 50

Statistical analysis 51

RESULTS AND DISCUSSION 52

Effect of antibiotics on shoot regeneration and rooting 52

Regeneration of transgenic shoots 54

Gus assay 57

PCR analysis 58

LITERATURE CITED 61

Chapter 3. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Dendranthema grandiflorum with Lsi2 Gene 67

1. Effect of Silicate Source on Growth of the Lsi2 Transgenic Chrysanthemum 'Brighton' 68

ABSTRACT 68

INTRODUCTION 70

MATERIALS AND METHODS 73

RESULTS AND DISCUSSION 83

LITERATURE CITED 99

2. Effect of Silicon Application on Responses to Drought and Heat Stresses of the Lsi2 Transgenic Chrysanthemum 'Brighton' 106

ABSTRACT 106

INTRODUCTION 108

MATERIALS AND METHODS 112

RESULTS AND DISCUSSION 119

LITERATURE CITED 137

GENERAL CONCLUSIONS 147

초록 150

Table 1. Effect of BA concentration, explant, and cultivar on the number of adventitious shoots regenerated and frequency of shoot induction measured at four weeks after propagation on the MS medium supplemented with BA alone 23

Table 2. Effect of BA concentration on number of shoots regenerated and percent shoot induction from different explants in six cultivars after four weeks of culture 24

Table 3. Effect of PGR combination, explant, and cultivar on the number of adventitious shoots formed and percent shoot induction from the explant measured at four weeks after culture 26

Table 4. Effect of PGR combination on number of shoots regenerated and percent shoot induction from different explants in six cultivars after four weeks of culture 27

Table 5. Effect of IAA on the number of roots formed per explant and percent root induction in ‘Brighton’ after four weeks of culture 35

Table 6. Shooting response of the petal explant of ‘Orlando’ cultured on the MS medium supplemented with kanamycin for first selection of putative transgenic plants 53

Table 7. Rooting response of shoots of ‘Orlando’ cultured on the MS medium supplemented with kanamycin for second selection of putative transgenic plants 54

Table 8. Effect of co-cultivation period with Agrobacterium and explant position on shoot induction from the petal explant of ‘Orlando’ on the SIM containing 7.5 mg·L-1 kanamycin(이미지참조) 56

Table 9. The supplementation of Si from different Si source and compositions of the nutrient solutions used in this experiment 82

Table 10. Effect of silicate source used on root growth of the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ after 2 weeks of culture 88

Table 11. Effect of silicate source used on contents of mineral elements in the root of the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ after 2 weeks of culture 95

Table 12. Effect of silicate source used on contents of mineral elements in the shoot of the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ after 2 weeks of culture 96

Table 13. Effect of Si application on ELP, Fv/Fm, and leaf angle in the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ grown in a recirculated nutrient solution in an ebb and flow system for a month and then maintained without irrigation for 7 days 121

Table 14. Effect of Si application on plant temperature, ELP, Fv/Fm, and leaf angle of the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ grown in a recirculated nutrient solution in an ebb and flow system for a month and then exposed to a 40℃ temperature for 30 h 123

Table 15. Effect of Si application on the contents of elements in the shoot and root of the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ grown in a recirculated nutrient solution in an ebb and flow system for a month and then maintained without irrigation for 7 days 134

Table 16. Effect of Si application on the contents of elements in the shoot and root of the Lsi2 transgenic ‘Brighton’ grown in a recirculated nutrient solution in an ebb and flow system for a month and then exposed to a 40℃ temperature for 30 h 135

국화는 세계적으로 절화, 분화, 그리고 초본성 화단식물로 주로 재배되는 아주 인기 있는 작물로, 상업적 및 관상적 가치가 커 시장이 빠르게 증가하고 있다. 국화의 식물체 재분화 능력을 이용한 대량증식, 품질개선, 그리고 유전적 특성을 개선하기 위한 형질전환에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.

규소는 토양 내에서 산소 다음으로 풍부한 원소이다. 현재까지 규소는 식물의 필수원소에는 포함되지 않지만 여러 작물에서 규소 시용에 따른 생물적, 비생물적 스트레스에 대한 저항성 증대, 그리고 작물의 생산성과 품질 향상과 같은 효과가 인정되고 있다. 하지만 무토양 배지에서 재배되는 원예작물에서의 규소시용 효과에 대한 연구는 아직 부족하다. 규소흡수를 증진시켜 줄 수 있는 transporter 유전자(Lsi gene)을 삽입한 형질전환 국화를 만들면 규소를 빨리 흡수할 뿐만 아니라 흡수된 규소의 뿌리로부터 지상부로의 이동도 촉진할 것으로 예상된다. 본 연구는 규소 흡수를 증진시키기 위하여 Lsi2 유전자를 국화에 삽입하여 형질전환된 식물체를 얻고 이 식물체의 규소 흡수 능력과 스트레스에 대한 반응을 조사하기 위하여 수행하였다.

제 1장 몇 가지 국화 품종에서 절편제와 생장조절제가 신초 재분화에 미치는 영향

국화 6품종의 잎, 꽃잎, 엽병, 그리고 줄기를 BA를 단용 또는 IAA와 kinetin과 혼용 처리하여 재분화 정도를 조사하였다. 식물생장조절제에 따른 각 품종들의 재분화 효율은 유의적으로 달랐다. 네 가지 다른 절편체(잎, 줄기, 엽병, 그리고 꽃잎) 중에서는 'Brighton' 품종의 꽃잎절편체에서 절편체당 발생한 신초수와 신초발생율이 가장 높았다. 재분화된 신초의 발근을 위해 IAA를 처리한 결과 0.5~1.5mg·L-1 농도에서 식물체당 발생한 뿌리수와 발근율이 가장 높았다. 정상적으로 발근한 식물체를 1주일간 순화과정을 거친 후 온실에서 재배하는데 성공하였다.

제 2장 Agrobacterium tumefaciens을 이용한 국화의 GUS 유전자 형질전환

꽃잎 절편체에 Agrobacterium을 이용한 GUS 유전자의 효율적인 형질전환 체계를 확립하였다. 온실에서 재배되고 있는 국화의 꽃잎을 기내에서 소독한 후, 세 부분으로 나누어 아랫부분을 position 1, 중간부분을 position 2, 그리고 끝부분을 position 3으로 칭하고 position 1과 2의 절편체를 이틀 동안 1.0mg·L-1 IAA, 1.0mg·L-1 BA, 그리고 0.1mg·L-1 kinetin을 함유한 MS배지에서 전배양하였다. 전배양된 절편체를 pCAMBIA 2301을 가지는 Agrobacterium LBA4404로 감염시킨 후, kanamycin 농도와 공동배양기간이 형질전환된 식물체의 재분화에 미치는 영향을 조사하였다. Position 2(꽃잎 절편체의 중간 부분)절편체를 2일 동안 공동배양시 재분화 효율이 가장 높았다. 형질전환된 식물의 선발을 위해 첨가한 kanamycin 농도로는 신초 발생시에는 7.5mg·L-1, 뿌리 발생시에는 20.0mg·L-1가 적합하였다. kanamycin에 내성을 가지는 식물체를 GUS assay와 PCR 분석을 통해 형질전환 여부를 확인한 결과 꽃잎을 절편체로 사용한 국화 형질전환이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.

제 3장 Agrobacterium를 이용한 국화의 Lsi2 유전자 형질전환

1. 네 가지 규산염 처리가 Lsi2 형질전환된 국화 'Brighton'의 생장에 미치는 영향

앞에서 확립된 GUS 유전자 형질전환 프로토콜을 이용하여 Lsi2 유전자를 국화에 삽입한 형질전환체를 선발하고, 4종류의 규산염 처리가 이들의 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 온실에서 재배되고 있는 국화의 잎을 채취하여 기내에서 소독한 후, 1.5mg·L-1 IAA, 1.5mg·L-1 BA, 그리고 0.1mg·L-1 kinetin이 함유된 MS배지에서 2일 동안 전배양하였다. Lsi2 유전자가 재조합된 binary vector를 운반하는 Agrobacterium GV3101을 전배양된 절편체에 접종시켰다. 약 2달 후 kanamycin에 내성을 가지는 식물을 선발하여 PCR 분석을 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 형질전환된 식물체의 규소 시용효과를 검증하기 위하여 4종의 규산염(CaSiO₃, fumed silicate, K₂SiO₃, 그리고 Na₂SiO₃)을 이용하여 0, 50, 또는 100mg·L-1 Si 농도로 처리하였고, 양액의 EC는 1.8mS·cm-1, pH는 6.0으로 조절하였다. 식물체는 300mL의 양액이 든 350mL 마젠타박스에서 재배하면서 튜브를 에어펌프에 연결하여 공기를 공급하였다. 재배 개시 14일 후 형질전환된 국화를 energy dispersive spectroscopy(EDS)를 이용하여 뿌리, 그리고 wavelength dispersive spectroscopy(WDS)를 이용하여 잎에 축척된 규소 입자를 관찰하였고, inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy(ICP-AES)를 이용하여 식물체 내에 존재하는 규소와 다른 원소들의 함량을 조사하였다. 형질전환된 국화에 첨가된 모든 규산염에 의해 식물체의 규소 함량이 높아졌다. CaSiO₃ 처리에서 전반적으로 Ca, K, P, Mg, 그리고 S의 함량이 증가하였고, Fe와 Na의 �t량이 감소하였다. 그 다음으로는 Na₂SiO₃, K₂SiO₃, 그리고 fumed silicate의 순으로 Ca, K, P, Mg, 그리고 S의 함량이 증가하였고, Fe와 Na의 �t량이 감소하였다 또한 규소 처리구에서 뿌리털이 매우 발달하였는데, 그 뿌리털을 EDS로 관찰한 결과 높은 양의 규소가 검출되었다. WDS로 잎 표면을 관찰한 결과 규소 처리구에서 규소 입자가 검출되었다.

2. Lsi2 형질전환된 국화 'Brighton'에 처리한 규소가 건조와 고온 스트레스 내성에 미치는 영향