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Title Page

Contents

I. Introduction 10

II. Materials and methods 13

2.1. Plant material 13

2.2. Extraction and Isolation 13

2.3. Animals and treatments 23

2.4. Surgery 23

2.5. Histology 24

2.6. Immunohistochemistry 24

2.7. Statistical Analysis 25

III. Results 26

3.1. Effects of the extract on neuronal cell density in the CA1 region 26

3.2. Effects of the extract on COX-2 and OX-42 expression 29

3.3. Effects of the each fractions of C. chinensis on neuronal cell density in the CA1 region 31

3.4. Effects of the each BuOH fr. on neuronal cell density in the CA1 region 34

3.5. Effects of the each subfraction of Fr-II on neuronal cell density in the CA1 region 37

3.6. Effect of huzhangoside D on neuronal cell density in the CA1 region 40

IV. Discussion 43

References 47

Abstract 53

Abstract in Korean 55

LIST OF TABLE

Table 1. NMR Spectral Data of Huzhangoside D in Pyridine-d5 (400 MHz, 100 MHz)(이미지참조) 22

LIST OF FIGURE

Fig. 1. HPLC chromatogram of C. chinensis extract. 16

Fig. 2. HPLC chromatogram of BuOH fr.. 17

Fig. 3. HPLC chromatogram of F-II fr.. 18

Fig. 4. HPLC chromatogram of Subfr-1. 19

Fig. 5. HPLC chromatogram of Comp.1. 20

Fig. 6. Structure of huzhangoside D. 21

Fig. 7. Representative photomicrographs of cresyl violet-stained hippocampal regions of sham-operated group (A, a), vehicle-treated group (B, b) or C. chinensis [100 (C, c), 300 (D, d), and 1,000 (E, e) mg/kg]-treated... 27

Fig. 8. Neuronal density of hippocampal CA1 region 7 days after ischemia after C. chienesis treatment. Either vehicle or C. chienesis (100, 300 or 1000 mg/kg) was intraperitoneally injected at 0 and 90 min after 10... 28

Fig. 9. Inhibitory effects of C. chinensis on COX-2 expression (A, B, C) in the neocortex after 48h and OX-42 expression (D, E, F) in ipsilateral hemisphere 7d following 10 min of ischemia.... 30

Fig. 10. Representative photomicrographs of cresyl violet-stained hippocampal regions of sham-operated group (A, a), vehicle-treated group (B, b) C. chinensis (hexane fr. (C, c), BuOH fr. (D, d), EtOAc fr. (E, e) and... 32

Fig. 11. Neuronal density of hippocampal CA1 region 7 days after ischemia after the each fractions of C. chinensis treatment. Either vehicle or hexane fr., EtOAc fr., BuOH fr. and water fr. at dosages of 10 mg/kg was... 33

Fig. 12. Representative photomicrographs of cresyl violet-stained hippocampal regions of sham-operated group (A, a), vehicle-treated group (B, b) or Fr. - [I (C, c), II (D, d), and III (E, e) 10 mg/kg]-treated group.... 35

Fig. 13. Neuronal density of hippocampal CA1 region 7 days after ischemia after the each BuOH fr. treatment. Either vehicle or BuOH fr.(Fr-I, Fr-II and Fr-III at dosages of 10 mg/kg) was intraperitoneally injected at 0... 36

Fig. 14. Representative photomicrographs of cresyl violet-stained hippocampal regions of sham-operated group (A, a), vehicle-treated group (B, b) or Subfr [1 (C, c), 2 (D, d), 3 (E, e) and 4 (F, f) 10 mg/kg]-treated... 38

Fig. 15. Neuronal density of hippocampal CA1 region 7 days after ischemia after the each subfraction of Fr-II treatment. Either vehicle or Subfr.(Subfr-1, Subfr-2, Subfr-3 and Subfr-4 at dosages of 10 mg/kg) was... 39

Fig. 16. Representative photomicrographs of cresyl violet-stained hippocampal regions of sham-operated group (A, a), vehicle-treated group (B, b) or huzhangoside D 10 mg/kg (C, c)-treated group.... 41

Fig. 17. Neuronal density of hippocampal CA1 region 7 days after ischemia after huzhangoside D treatment. Either vehicle or huzhangoside D at dosages of 10 mg/kg was intraperitoneally injected at 0 and 90 min after... 42

LIST OF SCHEME

Scheme 1. Isolation of comp.1 from the extract of C. chinensis 15

초록보기

Clematis chinensis는 한의학에서 널리 쓰이고 있으며 최근에는 일부 성분이 COX-1, COX-2의 활성에 대한 억제작용으로 인한 항염작용에 대한 보고가 있었다. 하지만 아직까지 전뇌허혈 모델에서 신경보호 효과에 대해 연구는 되어 있지 않다.

이 연구에서는 C. chinensis가 흰쥐 전뇌허혈 모델에서 용량 의존적인 신경보호 효과가 있는지를 연구했다. 일시적 전뇌허혈에 대한 신경보호 효과를 CA1 부위의 세포가 얼마나 사멸하는지를 통해 검증하기 위해 four-vessel occlusion (4-VO) rat 모델을 사용했다. 염증 반응과 관련 있는 COX-2의 upregulation과 CD11b antibody (OX-42)의 활성을 얼마나 억제하는지도 관찰하였다. 신경보호 효과가 있는 유효성분을 찾아내기 위해서 effective-guided isolation을 시행했다. 추출물은 물, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올로 분획했으며 column chromatography를 반복했다. 구조는 mass spectra와 ¹H-NMR과 13C-NMR 분석을 통해 밝혔다.

이 연구에서 C. chinensis는 4-VO를 시행한 7일 후의 흰쥐에서 hippocampus의 CA1 부위에 있는 신경세포의 사멸을 감소 시켰으며, 허혈로 유도된 COX-2와 OX-42의 upregulation을 각각 줄였다. 유효성을 근거로한 분리를 통해서는 유효성분인 huzhangoside D를 mass spectra와 ¹H-NMR, 13C-NMR 분석을 통해서 밝혔다. 이 결과는 C. chinensis가 전뇌허혈로 인한 신경세포의 사멸을 막아 신경보호 효과가 있고 유효성분은 huzhangoside D라는 것을 밝힌 것이다. 면역조직학 연구를 고려해 보면, C. chinensis의 신경보호 효과는 COX-2의 upregulation과 microglia의 활성을 억제하는 항염작용에 기인할 것이다.

C. chinensis와 유효성분인 huzhangoside D는 심장발작, 허혈성 stroke, 다양한 신경 염증성 질환 같은 전뇌허혈 환자의 신경보호효과를 통해서 조직의 신경보호와 기능의 회복에 유효한 치료제로 사용될 수 있을 것이다.

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