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표제지

국문초록

목차

1. 서론 13

2. 실험재료 및 방법 16

2-1. Cell cultures 16

2-1-1. HCT-116(p53 wt), HCT-116(p53-/-) 16

2-1-2. U-2OS, SAOS-2, A549, HT-29 16

2-2. RNA 분석 16

2-2-1. Total RNA isolation 16

2-2-2. Reverse transcription. 17

2-2-3. Taqman miRNA Reverse transcription. 17

2-2-4. Real time PCR 17

2-3. Genomic DNA purify 18

2-4. Target expression vector 제작 18

2-4-1. MiRNA target site, mutant target site insert와 vector 준비 18

2-4-2. Ligation 19

2-4-3. Transformation ＆ cloning 확인 19

2-5. MiRNA expression vector 제작 19

2-5-1. Pre-miRNA와 mutant pre-miRNA insert 준비(with U6 loop) 19

2-5-2. Pre-miRNA와 mutant pre-miRNA insert 준비(without U6 loop) 20

2-5-3. Pri-miR-192와 mutant pri-miR-192 insert 준비 20

2-5-4. Vector 준비 20

2-5-5. Cloning 21

2-6. Pri-miR-192 promoter cloning 21

2-6-1. Insert와 vector 준비 21

2-6-2. Ligation ＆ Transformation 21

2-7. Phenol extraction ＆ Ethanol precipitation 22

2-8. Transfection 22

2-8-1. DNA transfection by Lipofectamine™ 2000 22

2-8-2. DNA transfection by LT-1 22

2-8-3. DNA transfection by pEI 22

2-9. p53 활성화를 위한 chemical 처리 23

2-9-1. Doxorubicin 처리 23

2-9-2. Nutline-3 처리 23

2-10. Luciferase assay 23

2-11. CAT-ELISA assay 24

2-12. β-galactocidase assay 24

2-13. Western Blot 24

2-14. pAVQ adenovirus system 25

2-14-1. pAVQ pri-miR-192, mt pri-miR-192 cloning 25

2-14-2. Adenovirus recombination. 26

3. 결과 27

3-1. Cancer cell line에서 miR-192, -215 level 확인 27

3-2. MiR-192, -215 target 제작 및 확인 27

3-2-1. MiR-192, -215에 대한 target construct 제작 27

3-2-2. MiR-192, -215의 target construct 효율 확인 28

3-3. Pre-miRNA expression vector 제작 및 확인 28

3-3-1. Pre-miRNA expression vector 제작 28

3-3-2. U6+1 pre-miR-192, -215 with loop expression vector의 효율 확인 29

3-3-3. U6+1 pre-miR-192, -215 without loop expression vector의 효율 확인 30

3-3-4. 7SL pre-miR-192, -215 expression vector의 효율 확인 30

3-4. Pri-miRNA expression vector 제작 및 효율 확인 31

3-4-1. Pri-miRNA expression vector 제작 31

3-4-2. Pri-miRNA expression vector 효율 확인 31

3-4-3. Tet-on stable cell line 제작 31

3-5. p53 단백질 활성에 의한 miRNA level 변화 32

3-5-1. Doxorubicin에 의한 p53 activation 확인 32

3-5-2. p53 activation에 의한 miR-192 level 변화 33

3-6. Pri-miR-192 promoter region cloning 및 assay 33

3-6-1. Pri-miR-192 promoter region 33

3-6-2. Pri-miR-192 promoter assay 34

3-7. MiR-192 processing을 확인하기 위한 construct 제작 34

3-8. pAVQ adenovirus system 35

3-8-1. pAVQ pri-miR-192 cloning 35

3-8-2. Transient하게 transfection하여 효과 확인 35

4. 고찰 36

Abstract 64

참고문헌 66

List of Tables

Table 1. Sequence of used primers 41

List of Figures

Fig. 1. Region in genomicDNA and sequence of miR-192,-215 43

Fig. 2. Preview of miR-192,-215 pathway 44

Fig. 3. MiR-215 and miR-192 are reduced in colon cancers compared to normal counter parts 45

Fig. 4. Reporter constructs containing miR-192 and miR-215 target site 46

Fig. 5. Target site containing reporter is down- regulated by endogenouse miR-192, -215 47

Fig. 6. Construction of pre-miR-192,-215 expression vectors 48

Fig. 7. Effect of U6+1 pre-miR-192 expression vector with U6 loop in colon cancer cell line 50

Fig. 8. Effect of U6+1 pre-miR-192 expression vector with loop in non-colorectal cancer cell line 52

Fig. 9. Effect of U6+1 pre-miR-215 expression vector with U6 loop 53

Fig. 10. Effect of U6+1 pre-miR-192 expression vector without U6 loop 54

Fig. 11. Effect of 7SL pre-miR-192 expression vector 55

Fig. 12. Construction of pri-miR-192 expression vectors and Tet-on system 56

Fig. 13. Transient transfection of pri-miR-192 expression vector 57

Fig. 14. miR-192 level by p53 activation 58

Fig. 15. Promoter region was regulated by p53 status 59

Fig. 16. Confirm of pri-miR-192 processing by p53 status 60

Fig. 17. Transient transfection of pAVQ pri-miR-192 for adenovirus system 61

초록보기

 MiR-192, -215의 expression은 tumor suppressor gene인 p53 단백질에 의해 조절된다고 보고되어 왔다. 또한 miR-192, -215의 발현이 정상적인 대장에서는 과발현하고 있지만, colon cancer로 발달되면서 발현 level이 감소한다고 알려져 있다. 따라서 본 학위논문에서 우리는 miR-192, -215의 expression이 colon cancer의 proliferation이나 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 또한 p53 단백질이 이전에 알려진 것과 같이 miR-192, -215의 transcription을 조절하는지를 확인하고, post-transcription 단계에서도 영향을 줄 수 있는지 확인하고자 하였다. 우리는 세포 내에 miR-192, -215를 expression시키기 위해 여러 가지 type의 expression vector를 만들었다. 먼저 U6 promoter와 7SL promoter를 이용하여 pre-miRNA를 expression시킬 수 있는 vector를 만들었고, CMV promoter를 이용하여 pri-miRNA를 expression시킬 수 있는 vector를 만들었다. 이러한 expression vector를 reporter가 포함된 target construct와 co-transfection하여 miRNA expression vector가 reporter construct에 작용하는 효과를 확인하였다. 각각의 expression vector들은 효과적으로 target을 down regulation하였고, 이 효과는 p53 단백질에 영향을 받지 않는 것으로 여겨진다. 또한 보고된 바와 같이 doxorubicin을 이용하여 p53 단백질을 activation시켰을 때 pri-miR-192와 mature miR-192 발현이 둘 다 증가하는 것을 확인하였고, 이것은 transcription 단계에서 p53 단백질에 의한 효과라 생각된다. 실제로 transcription 단계에서의 효과를 확인하기 위하여 pri-miR-192의 promoter construct를 제작하여 promoter assay를 수행하였고, p53 단백질과 MDM-2의 결합을 억제하는 nutlin-3에 의해 p53을 activation시켜 promoter activity가 증가하는 것을 확인하였다. 이 같은 결과로 p53 단백질은 miR-192, -215의 transcription을 증가시키고 processing이나 targeting에는 관여하지 않을 것으로 생각된다. 이상의 결과들은 pri-miR-192, -215와 pre-miR-192, -215가 p53 단백질의 영향을 받지 않고 일반적인 anti-tumoral genetic agents로써 이용될 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 추가적으로 이들을 therapeutic agent로 이용하기 위해 강력한 delivery system인 adenovirus shuttle vector에 cloning하였고, adenovirus를 이용하여 그 효과를 보고자 한다.

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