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Title Page

Contents

ABSTRACT 9

Introduction 10

1. Breast cancer 10

2. Trichosanthes kirilowii extract 10

3. STAT3 11

4. APOPTOSIS 14

5. Cell cycle control: G₂/M DNA damage checkpoint 15

6. Cucurbitacins 16

Materials and Methods 17

1. Reagents 17

2. Preparation of Trichosanthes kirilowii ethanol extract (TKE) 17

3. Cell culture 18

4. Cell viability assay 18

5. Flow cytometric analysis 19

6. JC-1 mitochondrial membrane potential analysis by FACs 19

7. Western blot analysis 20

8. Cytochrome C release 20

9. Reverse transcription- PCR 21

10. Immunocytofluorescence 21

11. Terminal nucleotidyl transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) assay 22

12. Invasion assay 22

13. Luciferase assay 23

14. Statistical analysis 24

Results 26

1. Effect of TKE on MDA-MB-231 cell viability 26

2. TKE induces apoptosis and G₂/M cell cycle arrest in MDA-MB-231 cells. 28

3. TKE controls the G₂/M phase-related factor 28

4. TKE induces apoptosis in MDA-MB-231 cells. 32

5. TKE induces apoptotic molecules in MDF-7 and MDA-MB-231 cells 32

6. TKE affects the mitochondrial membrane potentials 35

7. TKE inhibits constitutive and IL-6 induced STAT3 phosphorylation in a variety of human cancer cells 37

8. TKE inhibits constitutive STAT3 phosphorylation in a concentration- and time-dependent manner 39

9. TKE suppresses constitutive activation of c-Src and JAK 41

10. TKE inhibits STAT3 nuclear translocation in MDA-MB-231 cells 43

11. TKE represses STAT3 dependent reporter gene expression 45

12. TKE reduces the expression of cyclin D1, Bcl-xL, and VEGF 45

13. TKE inhibits invasion in MDA-MB-231 cells 48

14. Cucurbitacin D inhibits the proliferation of human breast cancer cell line. 50

15. CuD inhibits constitutive STAT3 phosphorylation in a time-dependent manner 52

16. CuD reduces the expression of cyclin D1, Bcl-2, and survivin 52

17. CuD causes apoptosis and G₂/M cell cycle arrest in MCF7 and MDA-MB-231cells. 54

18. CuD induces apoptotic molecules in MCF-7, SK-BR3, and MDA-MB-231 cells 56

DISCUSSION 58

Reference 62

국문요약 70

List of Tables

Table 1. Overall 5-year survival rate for each category 13

Table 2. Multivariate analysis for overall 5-year survival rate 13

Table 3. Sequence of primers for RT-PCR 25

List of Figures

Fig 1. Effect of TKE on cell viability. Cell viability of TKE at different... 27

Fig 2. Effect of TKE on cell cycle distribution of MDA-MB-231. Cells were... 30

Fig 3. TKE regulates the expression of G₂/M related proteins. (A, B) Cells... 31

Fig 4. TUNEL labeling of MDA-MB-231 cells treated with TKE. 33

Fig 5. Effect of TKE on the expression of apoptosis-related molecules. (A)... 34

Fig 6. TKE induces apoptosis via intrinsic mitochondria pathway. (A) MCF-7... 36

Fig 7. TKE suppresses phospho-STAT3 level in a variety of human breast... 38

Fig 8. The phosphorylation of STAT3 in MDA-MB-231 cells in concentration... 40

Fig 9. TKE suppresses constitutive activation of c-Src and JAK. (A, B)... 42

Fig 10. TKE inhibits the translocation of ST A T3 to the nucleus. 44

Fig 11. TKE suppresses the STAT3 transcription activity. Hep3B-pSTAT3... 46

Fig 12. TKE reduces the expression of cyclin D, Bcl-xL, and VEGF at... 47

Fig 13. TKE inhibits the invasion ability in MDA-MB-231 cells. (A)... 49

Fig 14. Effect of CuD on cell viability. Cells were treated with different... 51

Fig 15. CuD suppresses phospho-STAT3 level and there target gene in a... 53

Fig 16. Effect of CuD on cell cycle distribution of MCF7 and MDA-MB-231. 55

Fig 17. Effect of CuD on the expression levels of PARP cleavage. MCF-7 ,... 57

초록보기

 암에 의한 사망률은 국내에서 사망원인 1위로, 매년 그 수가 증가하고 있으며, 그 중 유방암은 우리나라 여성에서 매년 발병률이 증가하여 현재 여성 암 중 1위를 차지하고 있다. 이러한 유방암의 치료는 에스트로겐 리셉터(ER) 및 프로게스테론 리셉터(PR) 의 유무, HER2의 과발현 정도에 따라 치료 방법이 다르다. 그 중 ER, PR 및 HER2 가 모두 음성인 유방암의 경우, 전이성 유방암의 특징을 가지고 있으며 약물 치료를 위한 표적의 부재로 인해 치료 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 전이성 유방암을 치료하기 위한 연구 개발이 계속 활발히 진행 중에 있으며. 본 연구에서는 일반적으로 소갈 (당뇨)을 치료하고, 염증 억제에 탁월한 효능이 있는 천화분의 유방암 세포성장 조절 및 그 기전에 관한 연구를 시행하였다.

천화분 80% 에탄올 추출물을 다양한 유방암 세포주에 처리하였을 때, 세포 성장이 억제됨을 확인하였으며, 이러한 세포성장의 억제는 G2/M 세포주기 arrest를 통해 유도됨을 유세포분석기를 이용하여 확인하였다. 뿐만 아니라 G2/M 관련 molecular인 ATM 및 Chk2의 인산화도 관찰되었다. 결국 G2/M 세포주기 arrest로 인한 세포성장 억제는 caspase-3의 활성화, PARP 분해 등을 통한 유방암 세포주의 세포사멸을 유도하였다. 다음으로는 천화분에 의한 세포성장 억제의 기전연구를 시행하였다. 유방암 환자 중 5년 생존율이 낮은 집단에서 특히 높게 발현되는 STAT3를 천화분에 의해 조절되어지는지 관찰해 보았다. 그 결과 MCF7, MDA-MB-231, MCF7HER2+ 세포주 모두에서 STAT3 발현이 감소되었다. 뿐만 아니라, STAT3가 과발현된 MDA-MB-231 세포주에서 시간 및 농도 의존적으로 STAT3의 발현이 감소하였다. 또한 STAT3의 상위 단계의 molecular 인 Src 및 JAK 의 인산화 역시 감소하였으며, JAK inhibitor로 알려진 AG490을 함께 처리한 결과 천화분에 의한 STAT3의 감소는 JAK 신호전달 억제를 통해 일어난다는 것을 한 번 더 확인할 수 있었다. 결국 이러한 STAT3의 발현 감소는 핵 안으로의 STAT3 translocation을 억제하였으며, 실제 전사활성억제효능을 Hep3B-STAT3-luc 세포주를 이용하여 확인하였다. 결국 STAT3 전사활성억제는 STAT3의 target gene으로 알려진 cyclin D1, Bcl-xL 및 VEGF 등과 같은 세포주기 조절인자와 신생혈관성장인자의 단백질 및 mRNA level의 감소를 가져왔다. 또한, 암세포 전이에 중요한 신생혈관성장인자인 VEGF의 감소가 실제 전이능력 감소에도 실제적으로 영향을 미치는지 boyden chamber assay를 통해 관찰한 결과, 천화분의 농도 의존적으로 암세포 전이 능력이 감소하였다.

Cucurbitacin family 대부분에서 Jak-stat 기전 억제를 통한 항암 효과가 지속적으로 보고되고 있으며, 최근 천화분에서 분리한 cucurbitacin D가 간암 세포주에서 세포사멸 유도를 통한 항암 효과가 확인되었다. 하지만 다양한 cucurbitacin family 들 중 cucurbaticin D가 Jak-stat3 기전 억제를 유도하는지는 보고된 바 없다. 이에 본 연구에서는 천화분에 포함된 다양한 성분들 중 cucurbitacin D가 Jak-stat3 기전억제에 중요하게 작용할 것으로 기대하고 천화분과 마찬가지로 G2/M 세포주기 억제 및 Jak-stat3 신호전달 기전 억제를 통한 유방암 세포주의 세포성장 조절 여부를 확인하였다. 그 결과 다양한 유방암 세포주에서 세포성장억제가 관찰되었으며, cucurbitacin D에 의한 세포성장억제는 G2/M arrest를 유도하였으며 결국 PARP 분해를 수반하는 세포사멸을 유도하였다. 또한 stat3의 단백질 발현이 줄어들었으며, stat3의 target gene들인 Bcl-2, cyclin D1, survivin의 단백질 발현 역시 감소하였다. 특히 세포성장 억제는 STAT3가 과발현된 MDA-MB-231 세포주의 세포성장 억제가 가장 두드러지게 관찰되었으며, 추후 stat3 발현 의존적인 세포성장 억제여부는 다양한 실헙 기법을 통해 심도 있는 연구가 진행 될 예정이다.

이상의 결과를 종합한 결과, 천화분 에탄올 추출물은 다양한 유방암 세포주의 Jak-STAT3 신호전달억제를 통해 세포성장 억제를 유도하였으며 다양한 결과를 바탕으로 천화분이 유방암 세포주에서 stat3를 표적으로하는 항암 약물 치료제로서의 가능성을 보여준다.

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