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표제지

국문요약

목차

약어목록 10

서론 11

1. 면역 반응의 개요 11

2. MAVS의 특징과 인터페론 신호전달에 있어 MAVS의 기능 15

연구대상 및 방법 21

Cells 21

형질전환_ CaCl₂ method 21

Luciferase assay 21

Immuno-blotting 22

SV preparation and infection 22

GST pull down assay 23

Immunoprecipitation 23

결과 25

1. nGFP 벡터에 클로닝한 MAVS 절단체들의 활성화 관찰 25

2. 에스트로겐 수용체 벡터에 클로닝한 MAVS 절단체들의 활성화 관찰 29

3. MAVS의 CARD 부분을 포함하는 절단체 제작 및 활성화 관찰 32

4. MAVS의 점 돌연변이 제작 및 활성화 관찰 38

5. MAVS의 점 돌연변이가 IRF3/7의 인산화에 미치는 영향 41

6. MAVS 점 돌연변이의 TBK1에 대한 활성화 메커니즘 45

7. MAVS의 점 돌연변이와 MIB1, MIB2의 결합 유무 48

8. IRF3/7의 활성화에 있어 MIB2의 기능적 영향 관찰 51

9. MIB2의 활성화 메커니즘 53

고찰 59

참고문헌 63

영문요약 72

표목차

Table 1. MAVS 에 결합하는 단백질의 종류와 위치 및 그 기능 17

그림목차

그림 1. 세포 내 MAVS를 통한 인터페론 분비의 간략한 모식도 14

그림 2. MAVS와 결합하는 여러 단백질과 그 위치. 19

그림 3. nGFP 벡터에 클로닝한 MAVS 절단체들의 활성화 관찰. 28

그림 4. 에스트로겐 수용체 벡터에 클로닝한 MAVS 절단체들의 활성화 관찰. 31

그림 5. MAVS의 CARD 부분을 포함하는 절단체 제작 및 활성화 관찰. 37

그림 6. MAVS의 점 돌연변이 제작 및 활성화 관찰. 40

그림 7. MAVS의 점 돌연변이가 IRF3/7의 인산화에 미치는 영향. 44

그림 8. MAVS 점 돌연변이의 TBK1에 대한 활성화 메커니즘. 47

그림 9. MAVS의 점 돌연변이와 MIB1, MIB2의 결합 유무. 50

그림 10. IRF3/7의 활성화에 있어 MIB2의 기능적 영향 관찰. 52

그림 11. MIB2의 활성화 메커니즘. 58

초록보기

연구배경

세포가 바이러스에 감염이 되면 세포질 내부에 존재하는 RIG-I, MDA5, LGP2 같은 단백질에 의해서 증식하는 바이러스 유전자가 감지되고, RIG-I 나 MDA5 에 있는 CARD 부분이 MAVS의 CARD 부분과 결합하게 되어 MAVS 를 활성화시키게 된다. MAVS 는 약 540개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 소포체에서 합성이 된 다음 미토콘드리아 외막으로 이동하여 위치하게 된다. 많은 바이러스들은 생존전략으로 MAVS 를 절단하는 면역회피 기전을 보유하고 있는데, MAVS 는 신호를 전달받아 그 하위로 인터페론을 분비하도록 신호를 전달해주는 중간매개체로서 중요한 역할을 하고 있기 때문이다. 활성화 된 MAVS 는 하위 신호전달 체계를 통해 MAPK, NF-κB, 그리고 IRF3 를 활성화 시켜IFN-β 를 분비하도록 유도하거나, IRF7 을 활성화시켜 IFN-α 들을 분비하게 한다. 하지만 아직 MAVS 의 어느 부위가, 어떠한 기전을 통해서 IRF3 와 IRF7 을 활성화 시키는지는 아직 명확하게 규명되지 않은 상태이다.

연구목적

본 연구에서는 MAVS 가 RIG-I 나 MDA5 에 의해 활성화 되었을 때, 어떤 부위가 인터페론 분비에 있어 중요한 전사인자인 IRF3/7 을 활성화 시키는지를 찾아내는 것을 목표로 하였다. 이를 위해 MAVS 변이체를 이용하여 활성화에 있어 중요한 역할을 하는 매개 단백질이 무엇인지를 찾아내고, 그 매개 단백질은 어떤 기전을 통해 IRF3/7 을 활성화 시키는지를 규명하고자 하였다.

연구방법

MAVS 의 단백질 2차 구조에 영향을 주지 않는 부분을 선택하여 다수의 절단체를 제작하였고 이들을 이용한 프로모터 실험을 통해 IRF3 와 IRF7의 활성화에 관여하는 부분이 어디인지를 규명하였다. 그 다음 세부적으로 점 돌연변이체를 제작하여 활성화에 관련된 기전을 규명하고자 하였고, 이러한 접근법을 통해 MAVS 가 하부로 신호를 전달하는 데 필요한 단백질을 찾고, 그 활성화 메커니즘을 알아보고자 하였다. 여러 절단체를 위해 설계한 프라이머들을 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하고 이들을 각각 클로닝 하였다. 이를 이용하여 인터페론 유전자들의 프로모터를 자극하는 실험을 수행하였고, 이를 통해 IRF3/7 을 활성화 하는 부분을 찾아가며 범위를 좁혀 가장 중요한 부위를 규명하였다. 그 다음 점 돌연변이체를 이용하여 결합하는 단백질을 찾기 위한 GST pull-down 및 면역 침강법 그리고 질량 분석법을 시행하였다. 찾아낸 단백질의 유전자를 과발현 시키거나, shRNA 를 통해 발현을 저해시켜 IRF3/7 의 활성화에 미치는 영향과 기전을 연구하였다.

연구결과

MAVS 절단체를 이용한 프로모터 분석법을 통해 MAVS 의 신호전달은 다량체화에 의해 유도된다는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 MAVS 아미노산 406~450 사이가 IRF3/7 을 활성화시켜 인터페론의 분비에 영향을 주었다. 이 사이에 제작된 점 돌연변이 중 MAVS 아미노산 439 와 440 부분에 돌연변이가 생기면 IFN-α 의 분비에 문제가 생겼고, 이를 이용하여 ubiquitin ligase 인 MIB1, MIB2 를 찾아내었다. 이후 결합분석을 시행한 결과 MIB2 가 MAVS 아미노산 439 와 440 에 결합한다는 것을 확인하였고, MIB2 를 과발현 또는 저해시켜본 결과 IRF3/7 의 기능에 영향을 주었다. 또한, 여러 ubiquitin 변이체를 이용하여 MIB2 의 활성화 메커니즘에 대해 살펴본 결과, MIB2 는 K63 관련ubiquitination 을 활성화 시키며 이는 MAVS에 의해 유도되었다.

결론

다량체화를 통해 신호를 전달하는 MAVS 는 아미노산 439 와 440 부분에 돌연변이가 생기면 IRF3/7 의 활성화를 통한 인터페론 분비가 불가능해진다. 이 부분에는 ubiquitin ligase 인 MIB2 가 결합하여 K63 관련 ubiquitination 을 활성화시킨다.

참고문헌 (57건) : 자료제공( 네이버학술정보 )

참고문헌 목록에 대한 테이블로 번호, 참고문헌, 국회도서관 소장유무로 구성되어 있습니다.
번호 참고문헌 국회도서관 소장유무
1 A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. 네이버 미소장
2 Defective LPS Signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr Mice: Mutations in Tlr4 Gene 네이버 미소장
3 The V Proteins of Paramyxoviruses Bind the IFN-Inducible RNA Helicase, mda-5, and Inhibit Its Activation of the IFN-β Promoter 네이버 미소장
4 The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. 네이버 미소장
5 Immune Signaling by RIG-I-like Receptors 네이버 미소장
6 5′-Triphosphate RNA Is the Ligand for RIG-I 네이버 미소장
7 IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. 네이버 미소장
8 Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus 네이버 미소장
9 Identification and Characterization of MAVS, a Mitochondrial Antiviral Signaling Protein that Activates NF-κB and IRF3 네이버 미소장
10 VISA Is an Adapter Protein Required for Virus-Triggered IFN-β Signaling 네이버 미소장
11 The coxsackievirus B 3C protease cleaves MAVS and TRIF to attenuate host type I interferon and apoptotic signaling. PLoS pathogens 2011;7(3):e1001311. 미소장
12 Enterovirus 71 protease 2Apro targets MAVS to inhibit anti-viral type I interferon responses. 네이버 미소장
13 Cleavage of mitochondrial antiviral signaling protein in the liver of patients with chronic hepatitis C correlates with a reduced activation of the endogenous interferon system 네이버 미소장
14 Hepatitis C Virus Protease NS3/4A Cleaves Mitochondrial Antiviral Signaling Protein off the Mitochondria to Evade Innate Immunity 네이버 미소장
15 Influenza virus protein PB1-F2 inhibits the induction of type I interferon by binding to MAVS and decreasing mitochondrial membrane potential. 네이버 미소장
16 Human metapneumovirus M2-2 protein inhibits innate cellular signaling by targeting MAVS. 네이버 미소장
17 Molecular cloning and functional characterization of porcine IFN-beta promoter stimulator 1 (IPS-1). 네이버 미소장
18 Identification of MAVS splicing variants that interfere with RIGI/MAVS pathway signaling 네이버 미소장
19 A functional C-terminal TRAF3-binding site in MAVS participates in positive and negative regulation of the IFN antiviral response 네이버 미소장
20 TRAF5 is a downstream target of MAVS in antiviral innate immune signaling. 네이버 미소장
21 DEAD/H BOX 3 (DDX3) helicase binds the RIG-I adaptor IPS-1 to up-regulate IFN-beta-inducing potential. 네이버 미소장
22 WDR5 is essential for assembly of the VISA-associated signaling complex and virus-triggered IRF3 and NF-kappaB activation. 네이버 미소장
23 Targeting IRFs by ubiquitination: regulating antiviral responses. 네이버 미소장
24 NLRC5 Negatively Regulates the NF-κB and Type I Interferon Signaling Pathways 네이버 미소장
25 Regulation of the innate immune response by threonine-phosphatase of Eyes absent. 네이버 미소장
26 Regulation of antiviral responses by a direct and specific interaction between TRAF3 and Cardif. 네이버 미소장
27 Orchestrating the interferon antiviral response through the mitochondrial antiviral signaling (MAVS) adapter 네이버 미소장
28 TRADD Protein Is an Essential Component of the RIG-like Helicase Antiviral Pathway 네이버 미소장
29 The novel tail-anchored membrane protein Mff controls mitochondrial and peroxisomal fission in mammalian cells. 네이버 미소장
30 Virus-infection or 5'ppp-RNA activates antiviral signal through redistribution of IPS-1 mediated by MFN1. PLoS pathogens 2010;6(7):e1001012. 미소장
31 Tom70 mediates activation of interferon regulatory factor 3 on mitochondria 네이버 미소장
32 Erratum: STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling 네이버 미소장
33 The Adaptor Protein MITA Links Virus-Sensing Receptors to IRF3 Transcription Factor Activation 네이버 미소장
34 ERIS, an endoplasmic reticulum IFN stimulator, activates innate immune signaling through dimerization. 네이버 미소장
35 MPYS, a novel membrane tetraspanner, is associated with major histocompatibility complex class II and mediates transduction of apoptotic signals. 네이버 미소장
36 Licochalcone A induces apoptosis through endoplasmic reticulum stress via a phospholipase Cγ1-, Ca2+-, and reactive oxygen species-dependent pathway in HepG2 human hepatocellular carcinoma cells 네이버 미소장
37 The Atg5-Atg12 Conjugate Associates with Innate Antiviral Immune Responses 네이버 미소장
38 Negative regulation of MAVS-mediated innate immune response by PSMA7. 네이버 미소장
39 PCBP2 mediates degradation of the adaptor MAVS via the HECT ubiquitin ligase AIP4 네이버 미소장
40 The E3 ubiquitin ligase RNF5 targets virus-induced signaling adaptor for ubiquitination and degradation. 네이버 미소장
41 Negative Regulation of the RIG-I Signaling by the Ubiquitin Ligase RNF125 네이버 미소장
42 Ubiquitin-regulated recruitment of IkappaB kinase epsilon to the MAVS interferon signaling adapter. 네이버 미소장
43 Polo-like kinase 1 (PLK1) regulates interferon (IFN) induction by MAVS. 네이버 미소장
44 c-Abl tyrosine kinase interacts with MAVS and regulates innate immune response 네이버 미소장
45 The tyrosine kinase c-Src enhances RIG-I (retinoic acid-inducible gene I)-elicited antiviral signaling. 네이버 미소장
46 MAVS Forms Functional Prion-like Aggregates to Activate and Propagate Antiviral Innate Immune Response 네이버 미소장
47 A Prion-like Trigger of Antiviral Signaling 네이버 미소장
48 Prion-like behavior of MAVS in RIG-I signaling 네이버 미소장
49 Mind bomb-2 is an E3 ligase for Notch ligand. 네이버 미소장
50 Mind Bomb Is a Ubiquitin Ligase that Is Essential for Efficient Activation of Notch Signaling by Delta 네이버 미소장
51 Exocrine pancreas development in zebrafish 네이버 미소장
52 Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. 네이버 미소장
53 Mapping a Dynamic Innate Immunity Protein Interaction Network Regulating Type I Interferon Production 네이버 미소장
54 NEMO binds ubiquitinated TANK-binding kinase 1 (TBK1) to regulate innate immune responses to RNA viruses. 네이버 미소장
55 The tumour suppressor CYLD is a negative regulator of RIG-I-mediated antiviral response. 네이버 미소장
56 The E3 ubiquitin ligase Nrdp1 'preferentially' promotes TLR-mediated production of type I interferon. 네이버 미소장
57 An obligatory role of mind bomb-1 in notch signaling of mammalian development. PloS one 2007;2(11):e1221. 미소장

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