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국문초록

목차

I. 서론 11

1. 말라리아 발생 현황 11

2. 말라리아 원충 15

3. 말라리아 원충의 생활사 19

4. 말라리아 진단 21

5. 시판 말라리아 신속진단키트진단 24

II. 실험 재료 및 방법 27

1. 재조합 Pf-LDH 및 Pv-LDH의 항원성 검증 27

2. 재조합 PfLDH 및 PvLDH를 이용한 단클론항체의 생산 27

1) 재조합 PfLDH 및 PvLDH를 이용한 생쥐의 면역화 27

2) 세포 융합 30

3) Hybridomas의 항체 생산능력 스크리닝 31

4) 융합세포종의 확립 및 클로닝 31

3. 항체 역가 측정 32

4. 단클론항체의 대량 생산 32

5. 단클론항체의 Isotyping 33

6. 단클론항체의 정제 33

7. 항원-항체 결합력 측정 34

8. 혈액 시료 34

III. 결과 및 고찰 35

1. 재조합 PfLDH와 PvLDH의 항원성 검증 35

2. 재조합 항원을 이용한 생쥐 면역화 37

3. 세포융합종이 생산하는 단클론항체와 항원의 반응성 40

4. 단클론항체의 isotype 결정 45

5. 단클론항체의 항원에 대한 결합력 47

6. 단클론항체의 대량생산 및 정제 50

7. 말라리아 신속진단키트 시작품 제작 53

8. 말라리아 신속진단키트의 성능 평가 60

IV. 요약 및 결론 66

참고문헌 68

Abstract 79

List of Tables

Table 1. Types of Malaria Rapid Diagnostic Tests. 23

Table 2. Comparison of evaluation reports of various RDTs 26

Table 3. Profiles of anti-pLDH monoclonal antibodies in this study 46

Table 4. Profiles of finally selected 4 monoclonal antibodies 49

Table 5. Analytical detection limits of Malaria Pf/Pan Ag kit 61

Table 6. Clinical performances of Malaria Pf/Pan Ag kit 62

List of Figures

Fig. 1. Malaria-endemic countries in the World. 14

Fig. 2. The spatial distribution of Plasmodium falciparum malaria stratified by endemicity class map in 2010 globally. 16

Fig. 3. The spatial distribution of Plasmodium vivax malaria endemicity map in 2010 globally. 18

Fig. 4. Life cycle of Plasmodium falciparum in the human body and the anopheline mosquito. 20

Fig. 5. Amino acid sequences of recombinant P. falciparum LDH(pET15b -PfLDH) and P. vivax LDH(pET21a-PvLDH). 28

Fig. 6. Schematic flow of monoclonal antibodies form recombinant pLDH. 29

Fig. 7. Imuunogenecities of recombinant Pf-LDH and Pv-LDH. 36

Fig. 8. Immunization of 4Balb/C mice using recombinant PfLDH. 38

Fig. 9. Immunization of 4Balb/C mice using recombinant PvLDH. 39

Fig. 10. Reactivities of anti-PfLDH monoclonal antibodies to recombinant PfLDH and recombinant PvLDH. 41

Fig. 11. Reactivities of anti-PvLDH monoclonal antibodies to recombinant PfLDH and recombinant PvLDH. 42

Fig. 12. Reactivities of 13 selected clones after the establishment and cloning. 44

Fig. 13. Klotz plots of finally selected 4monoclonal antibodies. 48

Fig. 14. Immunoaffinity chromatographic spectrum offinally selected mAbs. 51

Fig. 15. SDS-PAGE of 4 different kinds of the purified anti-pLDH monoclonal antibodies. 52

Fig. 16. Diagram of Malaria Pf/Pan Ag strip to diagnose the malaria infection. 55

Fig. 17. Plastic cassette of Malaria Pf/Pan Ag. 56

Fig. 18. Processes of Malaria Pf/Pan Ag kit production. 57

Fig. 19. User manual of Malaria Pf/Pan Ag kit developed in this study. 58

Fig. 20. Interpretation of Malaria Pf/Pan Ag kit results. 59

초록보기

 모기가 매개하는 열성 원충성 감염병인 말라리아는 세계적으로 가장 많은 사망자를 유발하는 질병 중 하나이다. 세계보건기구(WHO)는 말라리아 퇴치를 위한 다양한 전략을 제시하고 있는데, 신속 정확한 진단법의 개발 및 도입이 그 중 하나이다. 현재 말라리아 진단에 가장 많이 사용되는 방법은 신속진단키트(Rapid Diagnosis Tset, RDT)로써 128종 168개 제품이 개발, 시판되고 있으며, 최상위 제품들의 민감도 및 특이도가 95% 내외인 실정이다. 시판 신속진단키트의 90%가량이 열대열 말라리아 진단을 위해 HRP(Histidine -Rich Protein)을 타겟 항원으로 사용하고 있는데, 세계 곳곳에서 발견되는 HRP deficient P. falciparum과 과량의 항원, 항체에 의해 발생하는 prozone 효과에 따른 의양성 결과의 출현은 이들 HRP 탐지 진단시약의 효용성을 저하시키고 있다. 본 연구는 재조합 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)를 항원으로 이용하여 열대열 및 삼일열말라리아에 특이적인 단클론항체를 생산하고 이를 이용하여 HRP 기반 진단키트의 문제를 해결하는 동시에 우수한 성능을 보이는 새로운 말라리아 신속진단키트를 개발하고자 하였다.

시판 말라리아 RDT를 이용하여, 선행연구에서 확보된 재조합 열대열(P. falciparum, Pf) 및 삼일열(P. vivax, Pv) LDH의 항원성을 확인하였다. 재조합 단백질을 생쥐에 주사하여 면역화한 후, 지라세포와 myeloma의 세포융합을 통해 hybridoma를 만들고, 이들의 항체역가를 측정하여 PfLDH에만 특이적인 3종, PvLDH에만 특이적인 2종 및 PfLDH와 PvLDH 모두에 반응성이 좋은 8종 등 총 13종의 단클론항체를 선별하였다. 이들을 생산하는 융합세포종을 클로닝한 후 항원과의 반응성을 재확인하고, 단클론항체의 isotype을 고려하여 anti-PfLDH mAb로 1B3, anti-PvLDH mAb로 7D1, anti-panLDH mAb로 5G6와 7B9 등 4종의 단클론항체를 최종 선정하였다. Klotz plot으로 선별된 단클론항체들의 항원과의 결합력을 조사한 결과, 6.012~9.016×10-9의 해리상수값을 나타내 항원-항체의 결합력이 우수한 것으로 나타났다.

선별된 단클론항체 생산 세포주를 생쥐 복강에 주사한 후 복수액을 채취하고 protein-G immunoaffinity chromatograph로 항체를 정제하였다. 정제된 항체를 SDS-PAGE 분석한 결과 전형적인 IgG 단백질 band가 나타났으며, 불순단백질은 발견되지 않았다. Anti-PfLDH 항체인 1D3를 멤브레인의 T1 위치에 분주하고, anti-panLDH 항체인 7B9을 T2 위치에 분주하였으며, C 라인에는 goat anti-mouse IgG 항체를 분주한 후 고정시켰다. 나노골드 입자에 anti-panLDH 항체인 5G6를 결합시켜 conjugate를 제작하였으며 샘플패드, hemolysis pad, 콘쥬게이트패드, 흡수패드 및 플라스틱 카세트 등 부품을 조립하여 시제품을 제작하였다.

개발된 시제품의 검출한계는 열대열의 경우 ul당 60마리, 삼일열의 경우 ul당 250마리 수준으로 현장 적용이 가능한 수준이었다. 현미경검경법과 PCR법으로 확인된 음성 시료 450건, 열대열 시료 81건, 삼일열 시료 125건 및 열대열/삼일열 혼합감염 시료 5건 등 총 661건을 개발된 RDT로 진단한 결과, 열대열에 대한 민감도는 96.3%였으며, 삼일열에 대한 민감도는 95.2%, 특이도는 99.3%로 나타나 시판 제품 중 최상위 제품들에 비해 동등 이상의 성능을 보였다. 다만, 혼합감염 5건에 대해서는 3건을 열대열로, 2건은 삼일열로만 진단하여 혼합감염의 정확한 진단에 문제가 있는 것으로 나타났다. 이는 anti-PvLDH 항체인 7D1을 이용하여 향후 해결해야 할 과제이다.

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