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Title Page
Contents
CHAPTER I. CURRENT STATUS OF BIOCONTROL AGENTS IN CROP PROTECTION AREA 9
INTRODUCTION 10
HISTORY AND DEVELOPMENT OF BIOCONTROL AGENTS 11
CURRENT STATUS OF BIOCONTROL AGENTS 15
DISCUSSION 24
REFERENCES 26
CHAPTER II. ISOLATION OF PSEUDOMONAS OLEOVORANS STRAIN KBPF-004, WHICH SHOWS ACTIVITY AGAINST PLANT VIRUSES, AND VARIOUS ANTIVIRAL PROPERTIES 34
INTRODUCTION 35
MATERIALS AND METHODS 37
Screening of antiviral bacteria 37
Identification of the selected bacterial strain 39
Comparison of antiviral activity between strain KBPF-004 and ATCC 8062, type strain of Pseudomonas oleovorans 40
Antiviral characteristics of strain KBPF-004 40
Analysis of virus particle size change using TEM 41
Analysis of virus particle size change using PCR 43
Characteristics of antiviral activity of strain KBPF-004 culture filtrate using a local lesion host 47
Antiviral spectrum of strain KBPF-004 culture filtrate using a local lesion host 49
Antiviral spectrum of strain KBPF-004 culture filtrate using systemic hosts 50
Field trial of strain KBPF-004 culture filtrates on cucumber against Zucchini yellow mosaic virus 51
Analysis of characteristics for industrialization of strain KBPF-004 culture filtrate 53
RESULTS 54
Screening and identification of antiviral bacteria 54
Identification of bacterial strain 56
Comparison of antiviral activity between strain KBPF-004 and ATCC 8062, type strain of Pseudomonas oleovorans 62
Antiviral characteristics of strain KBPF-004 63
Analysis of virus particle size change using TEM 64
Analysis of virus particle size change using PCR 69
Characteristics of antiviral activity of strain KBPF-004 culture filtrate using a local lesion host 79
Antiviral spectrum of strain KBPF-004 culture filtrate using a local lesion host 85
Antiviral spectrum of strain KBPF-004 culture filtrate using systemic hosts 87
Field trial of strain KBPF-004 culture filtrates on cucumber against Zucchini yellow mosaic virus 89
Analysis of characteristics for industrialization of strain KBPF-004 culture filtrate 92
DISCUSSION 95
REFERENCES 102
CHAPTER III. MECHANISMS OF ANTIVIRAL ACTIVITY OF PSEUDOMONAS OLEOVORANS STRAIN KBPF-004 AND SEED TREATMENT EFFECTS ON TOBAMOVIRUSES. 106
INTRODUCTION 107
MATERIALS AND METHODS 110
Origin and maintenance of virus strains 110
Determination of seed transmission rate after treatment of pepper and watermelon seeds from infected plants with strain KBPF-004 culture supernatants 110
Subcellular localization of MP, CP and 126 kDa Protein of PMMoV and CGMMV after treatment with strain KBPF-004 culture supernatants 111
Western blot detection of GFP fusion proteins in agroinfiltrated leaves 112
RESULTS 113
Infectivity and seed transmission rate of PMMoV- and CGMMV- infected seeds following treatment with supernatant of P. oleovorans strain KBPF-004 cultures 113
Effects of supernatant of P. oleovorans strain KBPF-004 on 126 kDa, MP and CP of PMMoV. 115
DISCUSSION 120
REFERENCES 123
ABSTRACT 127
초록 132
Figure 1. Agrochemical active ingredients in development. 15
Figure 2. CAGR of synthetic pesticides and development cost difference with Biocontrol... 17
Figure 3. CAGR of biocontrol agents and market share by region. 18
Figure 4. Types of resources and formulations preferred as biocontrol agents. 18
Figure 5. CAGR of Korean pesticide market and market share by pesticide type. 19
Figure 6. A schematic diagram of the tobacco half-leaf method using N. tabacum cv. Xanthi-nc,... 38
Figure 7. Schematic diagram for TMV particle segmentation of strain KBPF-004 culture... 43
Figure 8. Structure of TMV nucleic acid and location of primer designed for PCR assay of... 45
Figure 9. A schematic diagram of the direct antiviral activity assay of strain KBPF-004 using N.... 48
Figure 10. A schematic diagram of the systemic or transitional antiviral activity assay of strain... 49
Figure 11. The appearance of a cucumber field that induced natural infection of ZYMV... 52
Figure 12. Scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM)... 57
Figure 13. 16s rRNA gene full sequence of strain KBPF-004. (1479bp) 59
Figure 14. The taxonomic location of strain KBPF-004 using Neighbor-joining tree based on... 60
Figure 15. The purified TMV particles have a rod shape structure with a length of 300 ㎚ and... 66
Figure 16. The pattern of segmented TMV particles according to concentration of strain KBPF-... 67
Figure 17. TEM photograph showing TMV particle segmentation effect of strain KBPF-004... 68
Figure 18. Effect of strain KBPF-004 culture filtrate on TMV genomic RNA amplification by... 69
Figure 19. Long fragment PCR efficiency analysis based on primer set.. (Control: TMV... 71
Figure 20. Long fragment PCR results by primer sets 5 and 6. TMV virus particles were mixed... 72
Figure 21. The standard curve of TMV obtained by real time PCR of serial dilution of in vitro... 74
Figure 22. TMV genomic RNA damage caused by strain KBPF-004 culture filtrate assayed by... 75
Figure 23. Effect of strain KBPF-004 culture filtrate on TMV genomic RNA damage assessed... 77
Figure 24. Local lesion occurrence patterns due to dilution of TMV particles quantities by real... 78
Figure 25. Direct control effect of strain KBPF-004 culture filtrate according to concentration... 80
Figure 26. Strain KBPF-004 culture filtrate maintains a high level of direct control effect up... 81
Figure 27. The transitional or systemic effect of strain KBPF-004 culture filtrate according to... 83
Figure 28. The systemic effect of strain KBPF-004 culture filtrate was maintained up to day +5... 84
Figure 29. The spectrum of antiviral activity of KBPF-004 assayed by C. amaranticolor 86
Figure 30. Cucumber which was infected with ZYMV and showed symptoms such as... 91
Figure 31. Heat stability of strain KBPF-004 culture filtrate. 92
Figure 32. Stability of strain KBPF-004 culture filtrate at 54 ℃. 94
Figure 33. Stability of strain KBPF-004 culture filtrates at room temperature. 94
Figure 34. Subcellular localization of coat protein (CP), movement protein (MP), and 126 kDa... 118
Figure 35. Subcellular localization of 126 kDa and movement protein of Pepper mild mottle... 119
초록보기
1. 농업분야에서 유기인계의 DDT 는 해충 방제에 매우 뛰어난 효과를 거두었지만, 인축 및 환경에 대한 안전성 문제가 대두되면서 시장에서 사라졌다. 그 이후로도 많은 수의 유기합성 농약이 개발되었지만 뛰어난 효과는 인정받는 반면 안전성 문제는 지속적으로 야기되었다. 최근에는 neonicotinoid 계 살충제가 꿀벌을 포함한 화분매개충의 개체군 밀도를 줄어들게 하는 원인으로 지목 받고 있다. 이러한 안전성 문제를 유발하는 화학농약의 대체제로서 미생물을 활용한 생물학적 방제제의 개발 시도되었다. Bacillus thuringiensis 를 이용한 Bt 제의 개발을 시작으로 곰팡이, 바이러스 등을 이용한 biocontrol agents 가 개발되었다. 대상 병해충에만 약효를 나타내는 특성 때문에 인간과 환경에 안전하다는 장점을 내세워 금방이라도 화학농약 시장을 대체할 것처럼 보였지만, 짧은 유통기한과 불 균일한 효과 등의 문제로 인해 시장은 좀처럼 커지지 않았다. 한편, 화학농약의 신규한 active ingredients 의 개발이 점차 어려워지고, 인축 및 환경에 대한 안전성 기준이 점차 강화자 2010 년도부터 다국적 화학회사들은 biocontrol agents 기업들은 인수합병하기 시작했다. 다국적 화학회사들은 biocontrol agents 분야에 공격적인 투자와 연구개발을 통해 화학농약의 안전성에 대한 약점을 극복하고 농산업 분야에서의 시너지 전략을 구사하고 있다. 이러한 관점에서 최근 살아있지 않는 미생물로 제조된 biocontrol agents 가 EPA 에 등록되고 있어 biocontrol agent 가 갖고 있는 단점인 짧은 유통기한과 불 균일한 약효 문제 등을 해결할 수 있는 실마리가 될 것으로 판단된다.
2 국내 담배 포장의 근권에서 분리된 Pseudomonas oleovorans strain KBPF-004 는 TMV 에 높은 활성을 갖고 있는 것이 확인되었다. P. oleovorans 의 type strain 인 ATCC8062 와의 비교를 통해 항바이러스 활성은 strain KBPF-004 만이 갖고 있는 것으로 나타났다. Strain KBPF-004 는 항생제 초민감성 대장균과 식물병원균에 대한 억제효과를 전혀 나타내지 않았다. 또한 생분해성 고분자인 PHA 에서는 어떠한 항바이러스 활성도 나타나지 않았다. Strain KBPF-004 배양여액을 정제된 TMV 입자에 처리하면 TMV 입자의 물리적인 분절이 발생하는 것을 TEM 을 통해 관찰하였다. 또한 Long fragment PCR 을 통해 물리적인 입자분절이 내부의 RNA 손상도 함께 동반한다는 것이 확인되었다. Long fragment PCR 검정에서 확인된 항바이러스 효과는 배양여액의 농도에는 비례하고, TMV 입자의 양에는 반비례하게 나타났다. 국부감염기주를 통해 밝혀진 strain KBPF-004 배양여액의 주요한 항바이러스 활성은 예방적인 것이며, 배양여액의 농도가 높을수록 지속기간과 활성의 정도가 높게 나타났다. 배양여액을 바이러스의 감염이 일어난 뒤에 처리할 경우 치료되는 효과는 미비했다. 다만 배양여액의 농도가 원액~1/10 수준의 고농도에서는 처리되지 않은 부분에서도 항바이러스 활성이 나타나고, D-1 에서 일부의 치료효과가 나타났다. Strain KBPF-004 배양여액의 스펙트럼은 국부감염기주를 통해 CMV 보다 TuMV 에 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다. 전신감염기주에서의 스펙트럼 검정을 통해 strain KBPF-004 배양여액은 potyvirus 인TuMV, ZYMV, PepMoV 에서 효과가 우수하고 fabavirus 인 BBWV 에는 효과가 저조하였다. 공교롭게도 바이러스 particle 의 구조가 막대형 혹은 선형인 바이러스에서는 활성이 높게 나타나고, 구형인 바이러스에서는 저조하게 나타났다. 건전한 오이 주변에 ZYMV 에 감염된 오이를 배치시키고 agricultural working 을 통해 ZYMV 감염을 유도하는 방식의 포장시험에서 strain KBPF-004 배양여액 500 배 처리구는 무처리구 대비 71.90%의 방제효과가 나타났다. Strain KBPF-004 배양여액은 10 분 정도의 짧은 열처리에는 매우 안정한 것으로 나타났다. Strain KBPF-004 배양여액을 54 ℃ 와 상온에서의 장기간 열안전성을 검정한 결과 54 ℃ 에서는 4 주차부터 활성이 감소되었지만, 상온에 보관할 경우 4 년까지도 안정적인 활성이 유지되었다.
3. 토양에서 분리된 P. oleovorans strain KBPF-004 는 기계적인 접촉감염을 일으키는 tobamoviru s에 항바이러스 활성을 나타냈다. 두 종류의 종자전염 tobamovirus 인 Pepper mild mottle virus (PMMoV), Cucumber green mottle virus (CGMMV)에 감염된 감염된 고추와 수박의 종자를 채취하여 항바이러스 활성을 평가하였다. 고추와 수박 종자에 P. oleovornas KBPF-004 나 type strain 인 ATCC 8062 의 배양 상등액을 정식 전에 처리하였다. 물이나 ATCC 8062 를 처리한 종자가 발아한 뒤 얻어진 PMMoV 나 CGMMV 의 감염률은 약 60% 인데 반해, KBPF-004 처리구의 종자에서의 바이러스 감염률은 20% 미만으로 나타날 정도로 명백하게 종자 감염을 억제하였다. 또한, P. oleovorans KBPF-004의 상등액은 Nicotiana benthamiana 에서 PMMoV 126 kDa 단백질의 remodeled aggregation 과 이동 단백질의 세포 내 위치의 이동을 일으키는데, PMMoV 126 kDa 단백질은 응집을 감소시키고 movement 단백질과 미세소관의 네트워크 연관성을 없앴다. PMMoV 또는 CGMMV 의 외피 단백질 (CP)을 발현하는 구조물을 agroinfiltrate 한 잎에서 P. oleovorans strain KBPF-004 의 상등액이 존재할 때 full size 보다 작은 크기의 CP 가 검출되었다. 이러한 변화는 P. oleovorans strain KBPF-004 의 항바이러스 효과에 기여할 수 있다고 판단된다.MARC 보기
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