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표제지

목차

약어정의 7

I. 서론 9

II. 실험재료 및 방법 13

1. 시약 및 항체 13

2. 세포 배양 및 초계배양 마우스 간실질세포의 분리 13

3. RNA 분리, semi-comparative RT-PCR 및 real-time PCR분석 14

4. Plasmid 제작과 reporter 유전자 활성 분석 17

5. 전세포 용해물의 분리와 immunoblot분석 18

6. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 분석 18

7. Electromobility shift 분석 19

8. Surface sensing of translation (SUn-SET)-immunoblot 분석 20

9. 세포생존률 분석 20

10. 루테올린의 분리 20

11. 재조합 아데노바이러스의 제작 및 동물실험 21

12. 혈액분석 22

13. 조직병리 22

14. 통계분석 23

III. 실험결과 24

Part. I. ATF6 의존성 SESN2 발현 유도 및 SESN2의 소포체 스트레스 매개성 간손상 보호효과 24

1. 소포체 스트레스 유도성 SESN2 발현 조절 24

2. 소포체 스트레스 유도성 SESN2 발현의 중요 전사인자로서의 ATF6 28

3. Human SESN2 promoter에 결합하는 ATF6 32

4. 소포체 스트레스 매개성 세포자멸사에 대한 과발현 SESN2의 방어작용 36

5. 소포체 스트레스 매개성 간손상 동물 모델에서 Ad-SESN2의 간보호 효과 43

Part. II. SESN2 발현을 활성화하는 루테올린의 소포체 스트레스 매개성 간손상 보호효과 49

1. 간세포에서의 루테올린에 의한 CHOP 발현 억제효과 49

2. 루테올린에 의한 UPR 신호 조절 효과 53

3. 루테올린에 의한 SESN2 발현 유도 56

4. 소포체 스트레스 매개성 간손상 동물 모델에서 루테올린의 간보호 효과 60

IV. 고찰 68

V. 결론 78

VI. 참고문헌 79

국문초록 85

Abstract 87

List of Tables

Table 1. Primers used in PCR analysis. 16

Table 2. Histomorphometrical analysis of hepatic tissues for investigating role of Ad-SESN2 on Tm-induced liver injury in ICR... 48

Table 3. Histomorphometrical analysis of hepatic tissue for evaluating effects of Lut on Tm-induced liver injury in ICR mice. 67

List of Figures

Fig. 1. ER stress induced SESN2 expression. 26

Fig. 2. ATF6 could act as an essential transcription factor for ER stress-mediated SESN2... 30

Fig. 3. UPRE-like elements in human SESN2 promoter contributed to ATF6-dependent... 35

Fig. 4. SESN2 overexpression suppressed CHOP and GPR78 mRNA levels, but not... 39

Fig. 5. SESN2 overexpression attenuated ER stress-induced apoptosis. 41

Fig. 6. Ad-SESN2 prevented Tm-induced liver injury in ICR mice. 46

Fig. 7. Ad-SESN2 attenuated Tm-mediated hepatocyte apoptosis. 47

Fig. 8. Lut inhibited Tg- or Tm-induced CHOP expression. 52

Fig. 9. Lut down-regulated UPR signaling (A) The effects of Lut on UPR signaling in... 54

Fig. 10. Lut induced SESN2 expression. 58

Fig. 11. Identification and isolation of Lut from peanut shell methanol extract. 62

Fig. 12. Lut prevent Tm-induced liver injury in ICR mice. 63

Fig. 13. Lut attenuated ER stress in hepatic tissue. 66

초록보기

 소포체 스트레스는 소포체 내 미성숙 및 비정상 폴딩 단백질의 축적으로 인해 소포체 기능 및 항상성이 파괴되는 것을 특징으로 하며, 다양한 간질환의 원인이 된다. 따라서 이러한 소포체 스트레스의 완화는 간세포의 항상성 유지, 더 나아가 급만성 간질환의 예방 및 치료에 필수적이다. 그러나 소포체 스트레스로부터 세포를 보호하는 기전은 아직 완전히 규명되지 않고 있는 실정이다. 이에 본 연구는 소포체 스트레스에 대한 Sestrin2 (SESN2) 와 루테올린 (3’,4’,5,7-tetrahydroxyflaTOne) 의 간보호효과 및 그 세부기전에 대해 탐구하고자 수행하였다. Tunicamycin (Tm)으로 유도한 소포체 스트레스에 의해 SESN2의 유전자, 전사활성 및 단백질의 발현이 증가하였다. Activating transcription factor 6 (ATF6)가 SESN2 promoter 내 unfolded protein response element (UPRE) 영역에 결합함으로써 SESN2의 전사활성 및 단백질의 발현을 증가시켰다. 게다가 dominant negative mutant of ATF6α와 siRNA 에 의한 ATF6α 의 knockdown 은 소포체 스트레스에 의한 SESN2 의 발현이 현저히 억제된 반면, PERK 나 IRE1 의 화학적 억제제는 SESN2 의 발현에 영향을 주지 않았다. 이는 ATF6 가 소포체 스트레스에 의한 SESN2의 발현 유도에 필수적인 역할을 담당하는 것을 의미한다. HepG2세포에 SESN2를 과발현시켜 Tm에 의한 CHOP and GRP78 유전자의 발현을 억제할 수 있었으며, 또한 SESN2의 과발현을 통해 JNK, p38의 인산화 및 cleaved PARP의 발현을 억제하여 과도한 소포체 스트레스에 의한 세포 독성으로부터 세포를 보호하였다. Tm 으로 간손상을 유발한 마우스 모델에서도 재조합 SESN2 아데노바이러스의 도입은 ALT, AST, LDH와 같은 혈액학적 지표 및 간조직 내 CHOP, GRP78 유전자의 발현을 감소시켰다. 더하여,조직병리학적 관찰을 통하여 소포체 스트레스에 의한 간세포의 변성 및 세포자멸사로부터 SESN2이 간조직을 보호할 수 있음을 확인하였다. 루테올린은 간세포에서 thapsigarin 또는 Tm 에 의한 CHOP 발현을 억제하였고, HepG2 세포에서 ATF6, IRE-sXBP1, PERK-eIF2α와 같은 UPR 신호 또한 유의하게 억제하였다. 루테올린은 UPRE-, ER stress response element-driven reporter 유전자의 전사활성 및 CHOP, GRP78, ERDJ4, ASNS와 같은 소포체 스트레스 유도성 하위 유전자군의 전사 또한 효과적으로 억제하였다. 게다가 루테올린은 전사조절을 통해 SESN2의 발현을 유도하며, 이는 antioxidant response element의 전사활성에 의존적이었다. 마우스에서도 Tm 에 의해 증가된 CHOP 과 GRP78 의 발현 및 간조직 변성, 세포자멸사를 루테올린의 투여에 의해 방어할 수 있었다. 이러한 결과들은 SESN2와 루테올린이 소포체 스트레스가 매개된 급만성 간질환에 새로운 약물작용점 및 후보 치료 약물로서의 가능성을 제시한다.

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