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Title Page

Abstract

Contents

CHAPTER I. Inactivation of surrogate bacteriophages for waterborne virus 16

I. Introduction 17

II. Material & method 20

A. Comparison of bacteriophage inactivation effect by gas source 20

B. Inactivation of bacteriophage using N₂plasma with direct method. 20

C. Plasma treatment of host and bacteriophage plaques. 21

D. Inactivation of bacteriophage using N₂ plasma with direct in phage suspension method. 21

E. Inactivation of bacteriophage using PBS/N₂plasma solution method. 22

F. Effect of antioxidant on bacteriophage during direct in phage suspension method. 22

G. Effect of inactivation by diluting PBS/N₂plasma solution. 23

H. Inactivation effect of storage duration and storage temperature on the PBS/N₂plasma solution. 24

I. Effects of plasma treatment on genomic DNA of PRD1. 24

J. Effect of plasma treatment on genomic DNA of ФX174 and genomic RNA of MS2. 25

K. Effect of plasma treatment on bacteriophage structure proteins. 25

L. Effect of plasma treatment on lipid peroxidation. 26

M. Anti-viral effects of underwater plasma devices equipped with bubblers. 26

III. Results 28

A. Comparison of bacteriophage inactivation effect by gas source 28

B. Inactivation of bacteriophage using N₂plasma with direct method. 28

C. Plasma treatment of host and bacteriophage plaques. 28

D. Inactivation of bacteriophage using N₂plasma with direct in phage suspension method. 29

E. Inactivation of bacteriophage using N₂plasma with PBS/N₂plasma solution method. 29

F. Effect of antioxidant on bacteriophage during direct in phage suspension method. 30

G. Effect of inactivation by diluting PBS/N₂plasma solution. 31

H. Inactivation effect of storage duration and storage temperature on the PBS/N₂ plasma solution. 31

I. Effects of plasma treatment on genomic DNA of PRD1. 32

J. Effect of plasma treatment on genomic DNA of ФX174 and genomic RNA of MS2. 32

K. Effect of plasma treatment on bacteriophage structure proteins. 33

L. Effect of plasma treatment on lipid peroxidation. 33

M. Anti-viral effects of underwater plasma devices equipped with bubblers. 34

IV. Discussion 35

CHAPTER II. Inactivation of HIV based lentivirus 76

I. Introduction 77

II. Material & method 79

A. Lentivirus infection. 79

B. Lentivirus GFP quantification. 79

C. MTT assay 79

D. Cell counting using Image-J program 80

E. Inactivation effect of PBS/N₂ plasma Storage time and temperature. 80

III. Results 82

A. Inactivation of lentivirus using PBS/N₂ plasma treatment. 82

B. Cytotoxic effect of PBS/N₂ plasma solution on U87 MG cell. 82

C. Comparison of bacteriophage inactivation effect and lentivirus inactivation efficiency. 83

D. Inactivation effect of PBS/N₂ plasma Storage time and temperature. 83

IV. Discussion 85

CHAPTER III. Inactivation of Bacillus endospore resistant to other inactivation methods 98

I. Introduction 99

II. Material & method 101

A. Bacillus atrophaeus endospore preparation 101

B. Inactivation of B.atrophaeus endospore using N₂ plasma with direct in suspension method and PBS/N₂ plasma solution method. 101

C. Comparison of inactivation ability among substances inactivating B.atrophaeus. 102

D. Effects of plasma treatment on genomic DNA of B.atrophaeus. 102

E. SEM images. 103

III. Results 104

A. Inactivation of B.atrophaeus endospore using N₂ plasma with direct in suspension method and PBS/N₂ plasma solution method. 104

B. Comparison of inactivation ability among substances inactivating B.atrophaeus. 104

C. SEM image of B.atrophaeus endospore and vegetative cell after plasma treatment 104

IV. Discussion 106

References 115

국문요약 121

List of Tables

CHAPTER I 15

Table 1. PRD1 Primer sequence and PCR product size. 57

Table 2. PRD1 DNA ratio using qPCR assay 59

Table 3. ФX174 Primer sequence and PCR product size. 61

Table 4. ФX174 DNA ratio using qPCR assay 63

Table 5. MS2 Primer sequence and PCR product size. 65

Table 6. MS2 DNA ratio using qPCR assay 67

CHAPTER III 15

Table 1. B.atrophaeus primer sequence and PCR product size. 110

Table 2. Comparison of endospore inactivation effects between plasma and... 112

List of Figures

CHAPTER I 11

Fig 1. Schematic illustration of the atmospheric pressure cold plasma system. 39

Fig 2. Comparison of bacteriophage inactivation effect by gas source. 40

Fig 3. Direct in bacteriophage method. 41

Fig 4. Direct in bacteriophage solution method. 42

Fig 5. PBS/N₂plasma solution method. 43

Fig 6. Plasma treatment using direct in phage method. 44

Fig 7. Plasma treatment of host and bacteriophage plaques. 45

Fig 8. Inactivation of bacteriophage using N₂plasma with direct in phage... 46

Fig 9. Inactivation of bacteriophage using N₂plasma with PBS/N₂ plasma... 47

Fig 10. Effect of antioxidant on PRD1 during N₂PBS with direct in phage... 48

Fig 11. Effect of antioxidant on ФX174 during N₂PBS with direct in phage... 49

Fig 12. Effect of antioxidant on MS2 during N₂PBS with direct in phage solution... 50

Fig 13. Effect of inactivation by diluting PBS/N₂plasma solution. 51

Fig 14. Inactivation effect of storage duration and storage temperature on the... 52

Fig 15. Inactivation effect of storage duration and storage temperature on the... 53

Fig 16. Inactivation effect of storage duration and storage temperature on the... 54

Fig 17. Agarose gel electrophoresis of PRD1 DNA treat with plasma. 55

Fig 18. PRD1 gene mapping for qPCR. 56

Fig 19. Agarose gel electrophoresis of PRD1 DNA PCR product. 58

Fig 20. ФX174 gene mapping for qPCR. 60

Fig 21. Agarose gel electrophoresis of ФX174 DNA PCR product. 62

Fig 22. MS2 gene mapping for qPCR. 64

Fig 23. Agarose gel electrophoresis of MS2 DNA PCR product. 66

Fig 24. Inactivation of PRD1 and change of bacteriophage PRD1 DNA ratio... 68

Fig 25. Inactivation of ФX174 and change of bacteriophage ФX174 DNA ratio... 69

Fig 26. Inactivation of MS2 and change of bacteriophage MS2 RNA ratio using... 70

Fig 27. SDS-PAGE analysis of PRD1 structure proteins. 71

Fig 28. SDS-PAGE analysis of ФX174 structure proteins. 72

Fig 29. SDS-PAGE analysis of MS2 structure proteins. 1: plasma non-treated... 73

Fig 30. Linoleic acid peroxidation of N2/PBS plasma solution. The lipid... 74

Fig 31. Anti-viral effects of underwater plasma devices equipped with bubblers.... 75

CHAPTER II 13

Fig 1. Schematic illustration of plasma treatment method. 1ml of PBS suspension... 87

Fig 2. Transduction mechanism of lenti-GFP virus. When the genome of the lenti-... 88

Fig 3. GFP expression in lentivirus-transduced cells after PBS/N₂plasma... 89

Fig 4. Quantification of green fluorescent protein extracted from U89MG cells... 90

Fig 5. Cytotoxic effect of pretreated PBS on U87 MG cell line, cell viability after...... 91

Fig 6. Comparison of green fluorescent protein quantitation and cell quantity.... 92

Fig 7. Inactivation effect of PBS/N₂plasma solution storage time and... 93

Fig 8. Inactivation effect of PBS/N₂plasma solution storage time and... 94

Fig 9. Inactivation effect of PBS/N₂plasma solution treatment on lentivirus and... 95

Fig 10. Inactivation effect of PBS/N₂plasma solution treatment on lentivirus... 96

Fig 11. Inactivation effect of PBS/N₂plasma solution treatment on lentivirus and... 97

CHAPTER III 14

Fig 1. Inactivation of B.atrophaeus endospore using N₂plasma with direct in... 108

Fig 2. B.atrophaeus dnak gene mapping for qPCR. 109

Fig 3. Agarose gel electrophoresis of B. atrophaeus DNA PCR product. 111

Fig 4. SEM images were obtained after treatment of inactivation substances in... 113

Fig 5. SEM images were obtained after treatment of plasma in B.atrophaeus... 114

초록보기

 우리 주변에는 많은 미생물이 있고, 그 미생물은 우리의 생명을 위협한다. 따라서 마시는 물과 지하수에 오염되어 있는 바이러스와 사람과 동물에게 감염되어 병을 일으키는 바이러스들을 불활성화 하는 것이 매우 중요하게 되었다.

이번 연구에서는 세 가지의 다른 타겟 미생물을 제 4의 상태인 플라즈마를 이용하여 불활성화 하였다. 세가지 타겟 미생물은 수처리 모델 바이러스인 박테리오파지(핵산의 조성과 구조에 따라 PRD1, ФX174, MS2를 사용)와 HIV의 모델 바이러스인 lentivirus, 마지막으로는 내성이 강한 내생포자이다. 각 실험은 챕터를 나누어 토의 하였다. 이번 실험에서 플라즈마의 가스는 질소가스를 사용하였고, 세가지 처리 방법을 고안하여 이용하였다. 실험 결과를 기반으로 세가지 플라즈마 처리 방법 중에서 직접 발생 처리 방법(direct in suspension method)이 가장 불홯성화 효과가 높았으며, 모든 모델 바이러스가 1분 안에 6 log 이상 불활성화 되었다. PBS / N₂ plasma solution 역시 바이러스 불활성화 효과가 좋았으며 실생활에서 사용과 보관이 용이하다. PBS / N₂ plasma solution는 4도씨에서 7일동안 보관을 해도 박테리오파지 불활성화 효과가 유지 되었고, -80도씨와 4도씨에서 28일 동안 보관을 해도 lentivirus 불활성화 효과가 유지 되었다. Real-time PCR과 아가로즈젤 전기영동을 통해 박테리오파지의 핵산이 손상 되는 것을 확인 하였고, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)을 통해 박테리오파지 구조 단백질 역시 손상되는 것을 확인하였다. 하지만 지질에는 플라즈마가 거의 영향을 미치지 않았다.

Lentivirus에 PBS/N₂ plasma 용액을 처리하고 숙주세포에 도입하면, 숙주세포의 세포독성은 없었고 lentivirus만 효과적으로 불활성화 하였다. 이것은 GFP 유전자가 삽입된 lentivirus의 형광단백질 발현이 적어지는 것을 형광현미경을 통해 확인하였다. 그리고 GFP를 순수분리하여 lentivirus가 불활성화 양을 정량적으로 확인하였다.

내생포자는 미생물 중에서 가장 내성이 강한 미생물이다. 그래서 내생포자를 플라즈마로 불활성화 하려면 플라즈마와 반응하는 시간이 필요하다. 플라즈마와 내생포자가 24시간 이상 반응하면 불화성화 효과가 급격하게 올라가고, 특히 직접 발생 처리 방법(direct in solution method)으로는 4log 이상, PBS/N₂ plasma 용액 방법은 2 log 이상 불활성화 하였다. 내생포자에 플라즈마를 적절한 처리 조건을 병행하여 처리 한다면, 다른 미생물 불활성화 방법(autoclave, UV)과 비슷한 불활성화 효과를 보였다. 플라즈마를 처리해도 내생포자의 외형변화는 크지 않았고, crack이라는 외형변화가 나타났다.

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