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Title Page

Contents

List of Abbreviations 9

요약 10

Chapter 1. General Introduction 14

Chapter 2. Effect of Different Wavelengths of Light on the Antioxidant and Immunity Status of Juvenile Rock Bream Oplegnathus fasciatus Exposed to Thermal Stress 17

Abstract 17

1. Introduction 19

2. Materials and methods 22

2.1. Experimental fish and environmental conditions 22

2.2. Total RNA extraction, cDNA synthesis, and quantitative real-time PCR (qPCR) 26

2.3. Western blot analysis 28

2.4. Analysis of plasma parameters 28

2.5. Terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay 29

2.6. Statistical analysis 30

3. Results 31

3.1. Expression and activities of antioxidants (SOD, CAT, and GPX) in the liver 31

3.2. Plasma H₂O₂ level 31

3.3. Plasma melatonin and lysozyme levels 31

3.4. Expression and activity of caspase-3 in liver 41

3.5. TUNEL assay 41

4. Discussion 46

Charter 3. Effects of Various Light Spectra on Physiological Stress and DNA Damage by Thermal Stress in Rock Bream Oplegnathus fasciatus 50

Abstract 50

1. Introduction 51

2. Materials and methods 53

2.1. Experimental fish and environmental conditions 53

2.2. Total RNA extraction, cDNA synthesis, and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) 56

2.3. AspAT/AlaAT, glucose, and cortisol levels in plasma 57

2.4. Comet assays 57

2.5. Statistical analysis 58

3. Results 59

3.1. Changes in HSP70 mRNA expression 59

3.2. Plasma AspAT/AlaAT levels 59

3.3. Plasma cortisol and glucose levels 59

3.4. Comet assays 66

4. Discussion 69

Chapter 4. General Discussion 72

References 75

List of Tables

Table 1. Primers used for qPCR amplification 27

List of Figures

Fig. 1. Spectral profiles of light emitting diodes (LEDs; green, 520 ㎚; red, 630 ㎚)... 25

Fig. 2. Expression levels of SOD (a), CAT (b), and GPX (c) mRNAs and proteins... 34

Fig. 3. Activities of plasma SOD (a), CAT (b), and GPX (c) in juvenile rock... 36

Fig. 4. Activities of plasma H₂O₂ in juvenile rock bream during thermal changes... 38

Fig. 5. Levels of plasma melatonin (a) and lysozyme (b) in juvenile rock bream... 40

Fig. 6. Change in the levels of expression of caspase-3 mRNA (a) and plasma... 43

Fig. 7. TUNEL detection of juvenile rock bream liver cell apoptosis under different... 45

Fig. 8. Spectral profiles of light emitting diodes (LEDs; green, 520 ㎚; red, 630 ㎚)... 55

Fig. 9. Changes in HSP70 mRNA expression in rock bream. Results are shown for... 61

Fig. 10. The levels of cortisol (A) and glucose (B) in rock bream livers. Results are... 63

Fig. 11. The activities of plasma AspAT (A) and AlaAT (B) in rock bream. Results... 65

Fig. 12. Comet assay images (A) and comet assay parameters (B; tail length,... 68

초록보기

 본 연구는 고수온 환경에 돌돔 Oplegnathus fasciatus를 노출시킨 후, 다양한 파장의 빛을 조사하면서 돌돔 체내에서 스트레스와 면역 반응을 포함한 생리학적 변화를 확인하기 위하여 수행되었다. 다양한 빛 파장에 의한 돌돔의 생리학적 반응을 관찰하기 위하여 분자생물학적 실험 방법을 통하여 비교·분석하였다.

1. 고수온 노출에 따른 돌돔의 항산화 반응 및 면역시스템에 미치는 빛 파장의 영향

본 연구에서는 고수온 환경에 노출된 돌돔의 체내에서 생성된 산화스트레스의 조절 및 면역지표 그리고 세포사멸에 미치는 특정 빛 파장의 효과를 확인하기 위하여, 돌돔을 고수온 환경(25 및 30℃)에 노출시킨 후 특정 빛 파장(형광등, 녹색 및 적색)을 세기별(0.25 및 0.5 W/m²)로 조사하면서 생리학적 변화를 관찰하였다.

하루에 수온을 1℃씩 상승시키는 수온 변화 환경(20 → 30℃)에 돌돔을 노출시킨 후, 수온 스트레스 요인에 의하여 어체 내에서 생성되는 활성산소를 제거하기 위한 항산화 물질[superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) 및 glutathione peroxidase (GPX)] 및 면역 지표(melatonin 및 lysozyme)의 변화를 분석하였다. 또한, 급격한 수온 변화에 따른 돌돔의 세포사멸 반응을 확인하기 위하여 caspase-3 및 hydrogen peroxide (H₂O₂)를 측정하였으며, 간 조직 내에서의 세포사멸 정도는 terminal transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay을 통하여 확인하였다.

급격한 수온 변화는 돌돔 체내에서 SOD, CAT, GPX mRNA 및 단백질 발현량 그리고 효소 활성을 유의적으로 증가시켰지만, 녹색 LED 파장을 조사한 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m²)와는 상관없이 항산화 유전자 및 단백질 발현 그리고 효소 활성은 유의적으로 감소되었음이 확인되었다. 또한, 본 연구에서는 고수온 노출에 따른 돌돔의 면역력 변화를 광원별로 비교한 결과, 녹색 LED 파장 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m²) 와는 상관없이 항산화 유전자 및 단백질 발현 그리고 효소 활성이 유의적으로 감소되는 경향이 확인되었다. 혈장 내 caspase-3 및 H₂O₂ 농도 수준을 분석한 결과에서도 고수온(25 및 30℃) 환경에 노출된 돌돔의 혈중 caspase-3 및 H₂O₂ 농도는 고수온에 노출된 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보였으나, 녹색 LED 파장 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m²)와는 상관없이 유의적으로 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 고수온 노출이 돌돔 간세포의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 TUNEL assay를 실시한 결과, 30℃ 고수온 실험구의 돌돔 간세포에서 세포사멸이 가장 많이 유발되었으나, 녹색 LED 파장을 조사한 30℃ 실험구에서는 오히려 세포사멸이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

이상의 연구 결과를 종합하여 보면, 25℃ 이상의 고수온 환경에 돌돔을 노출시킨 경우, 어체 내에서는 산화스트레스가 유발되었으며 이러한 산화스트레스에 대응하기 위하여 항산화 물질인 SOD, CAT, GPX mRNA 및 단백질 발현 그리고 효소 활성이 유의적으로 증가된 것으로 사료된다. 그러나 녹색 LED 파장의 조사는 오히려 산화스트레스를 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 25℃ 이상으로의 수온 변화는 돌돔 체내에서 H₂O₂ 농도를 증가시켜 caspase-3 활성을 유도함은 물론 결국에는 세포사멸까지도 유발시키는 것으로 사료된다. 즉, 고수온 환경은 어류에게 생리적 스트레스를 유발시키지만, 녹색 파장의 빛은 오히려 산화스트레스를 감소시키는 역할을 하며, 0.25 W/m²의 낮은 광량(세기)만으로도 항산화 능력 및 면역력을 증진시키는데 효과적인 것으로 판단되었다.

2. 고수온 노출에 따른 돌돔의 생리적 스트레스 및 DNA 손상에 미치는 빛 파장의 영향

본 연구에서는 고수온 환경에 노출된 돌돔의 체내에서 생성된 생리적 스트레스 및 핵 내 DNA의 손상에 미치는 특정 빛 파장의 효과를 확인하기 위하여, 돌돔을 고수온 환경(25 및 30℃)에 노출시킨 후 특정 빛 파장(형광등, 녹색 및 적색)을 세기별(0.25 및 0.5 W/m²)로 조사하면서 생리학적 변화를 관찰하였다.

하루에 수온을 1℃씩 상승시키는 수온 변화 환경(20 → 30℃)에 돌돔을 노출시킨 후, 수온 스트레스 요인에 의하여 손상된 단백질을 복구하기 위하여 생성되는 heat shock protein (HSP) 70의 변화를 분석하였다. 그리고 hypothalamus-pituitary-interrenal axis (HPI 축)을 중심으로 조절되는 생리학적 스트레스 반응(cortisol 및 glucose)과 스트레스로 인하여 발생되는 간 손상 정도를 확인하기 위하여 aspartate aminotransferase (AspAT)와 alanine aminotransferase (AlaAT) 값을 측정하였다. 또한, 고수온 노출에 따른 간세포 내 핵 DNA의 손상 정도를 확인하기 위하여 comet assay를 실시하여 분석하였다.

수온이 변화함에 따라 돌돔 체내에서는 HSP70 mRNA의 발현과 혈장 내 cortisol, glucose, AspAT 및 AlaAT 농도가 유의적으로 증가하였으며, 특히 30℃ 고수온 실험구에서 가장 높게 증가하였다. 그러나 녹색 LED 파장을 조사한 실험구에서는 대조구에 비하여 빛의 세기(0.25 및 0.5 W/m²)와는 관계없이 HSP70 mRNA의 발현과 cortisol, glucose, AspAT 및 AlaAT 농도가 유의적으로 감소하는 경향이 확인되었다. 또한, 고수온에 노출된 돌돔의 간세포 내 핵 DNA 손상 정도를 대조구와 비교해 본 결과, 30℃ 실험구의 돌돔 간세포에서 더 많은 손상이 발생하였지만, 녹색 LED 파장을 조사한 30℃ 실험구에서는 핵 DNA의 손상 정도가 감소된 것이 관찰되었다.

이상의 연구 결과를 종합하여 보면, 25℃ 이상의 고수온 환경에 돌돔을 노출시킨 경우, 어체 내에서는 HSP70 mRNA의 발현 그리고 cortisol, glucose, AspAT 및 AlaAT 농도가 유의적으로 증가하였을 뿐만 아니라 간세포 내 핵 DNA가 손상되는 등 생리적 스트레스가 다량으로 발생되었다. 그러나 녹색 LED 파장의 조사는 스트레스와 간세포 내 핵 DNA의 손상을 감소시키는 것으로 나타났으며, 특히 0.25 W/m²의 낮은 광량(세기)의 조사만으로도 고수온에 의한 스트레스를 감소시키는데 효과적인 것으로 판단되었다.

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