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Title Page

초록

Abstract

Contents

Chapter 1: General Introduction 14

Chapter 2: Repebody display on inclusion body and controlled permeabilization 21

2.1. Introduction 21

2.2. Materials and Methods 22

2.2.1. Generation of functional inclusion bodies and binder display thereon 22

2.2.2. Preparation of target proteins 22

2.2.3. Controlled cell-permeabilization by surface cracking 22

2.2.4. Fluorescence and electron microscopy 23

2.2.5. Flow cytometric analysis 23

2.2.6. Quantitative PCR (qPCR) 23

2.3. Results and Discussion 27

2.3.1. Characterization of functional inclusion bodies - CBD nanoparticles 27

2.3.2. Characteristics of the intracellular particle display (IPD) 27

Chapter 3: Applications of IPD based screening for the discovery of new affinity binders 40

3.1. Introduction 40

3.2. Materials and Methods 41

3.2.1. Construction of a IPD-based repebody library 41

3.2.2. Preparation of fluorescence-labelled targets 41

3.2.3. Screening on flow cytometry 41

3.2.4. ITC analysis 42

3.3. Results and Discussion 44

3.3.1. Application of flow cytometry-based screening by using mock-library 44

3.3.2. Low-false screening of target-specific repebodies from 107-library(이미지참조) 44

3.3.3. Permissible sizes of molecular target 45

Chapter 4: Affinity maturation by IPD based competitive screening 52

4.1. Introduction 52

4.2. Materials and Methods 53

4.2.1. Competitive screening 53

4.2.2. Purification of sfGFP-repebody complex for crystallization 53

4.2.3. Crystallization, data collection and structure determination 53

4.3. Results and Discussion 55

4.3.1. Affinity maturation of sfGFP-specific repebody by IPD and application using sfGFP-repebodies 55

4.3.2. Crystal structure of the sfGFP-repebody complex 55

Chapter 5: Techniques to enhance IPD applicability - Enforced Transcription of metagenome 65

5.1. Introduction 65

5.2. Materials and Methods 67

5.2.1. Reagents 67

5.2.2. Construction of the bi-directional T7 transposon 67

5.2.3. Random transposon insertion into the metagenome library and screening 67

5.2.4. NGS based sequence analysis 68

5.3. Results and Discussion 69

5.3.1. Metagenomic library construction 69

5.3.2. Effect of enforced transcription for metagenome screening 69

5.3.3. Sequencing based characterization of enforced transcription 70

Chapter 6: Stable and uniform expression system in Escherichia coli 79

6.1. Introduction 79

6.2. Materials and Methods 80

6.2.1. Materials 80

6.2.2. Construction of ChroV system 80

6.2.3. In vivo cloning in ChroV system 81

6.2.4. Expression of model proteins in ChroV-JM109(DE3) 81

6.2.5. Analysis and measurement 82

6.3. Results and Discussion 83

6.3.1. Construction of ChroV system in E. coli JM109(DE3) 83

6.3.2. Tight regulation and uniform expression of target genes 83

6.3.3. Stable expression of target gene in antibiotic-free conditions 84

Discussion 92

Overall Conclusion 94

Bibliography 96

Curriculum Vitae 106

List of Tables

Table 1. List of primers used in this study. 63

Table 2. Data collection and refinement statistics for sfGFP-H2C13 complex. 64

Table 3. Summary of tributyrin plate based metagenomic screening results. 75

Table 4. Summary of community analysis of the positive clones. 76

Table 5. Summary of BLAST results. 77

Table 6. Major annotated gene products of BLAST analysis. 78

List of Figures

Figure 1. Cellulose-binding domain from Cellulomonas fimi (PDB ID: 1EXH). 16

Figure 2. Schematic vector map of pRepebody-mRFP-CBD with features in detail. 25

Figure 3. Genetic constructs for the expression of the repebody-CBD IBs and GFP-IL6. 26

Figure 4. Schematic drawing of the protein scaffold to display the repebody on the CBD-inclusion body... 29

Figure 5. Bacterial cells inside with protein nanoparticles. 30

Figure 6. Bacterial cracked cells inside with protein nanoparticles. 31

Figure 7. Electron microscope images. 32

Figure 8. Fluorescence microscope images of permeabilized, centrifuged, and resuspended fluorescent... 33

Figure 9. Flow cytometry and microscopy analysis of freeze-thaw and acid treated cells. 34

Figure 10. Schematic representation of the intracellular particle display (IPD). 35

Figure 11. Characteristics of the intracellular particle display. 36

Figure 12. Analysis of cell cracking steps. 37

Figure 13. Calculation for the number of active binders on CBD IBs per cell. 38

Figure 14. Analysis of plasmid DNA in cracked cells. 39

Figure 15. Genetic constructs for the repebody library-CBD IBs and intended proteins. 43

Figure 16. Enrichment of positive cells by IPD. 46

Figure 17. Screening of affinity binders for four different targets. 47

Figure 18. Applications of IPD based screening for the discovery of new affinity binders. 48

Figure 19. Isothermal titration calorimetry analysis of the sfGFP-specific repebody maturation. 49

Figure 20. Isothermal titration calorimetry analysis for fluorescein-specific repebody. 50

Figure 21. Testing different sizes of exogenous target molecules. 51

Figure 22. Additional diversification modules for affinity maturation. 56

Figure 23. Applications of IPD based screening in affinity maturation. 57

Figure 24. Effect of molecular target concentration. 58

Figure 25. Effect of using unpurified targets. 59

Figure 26. The pattern of crystal packing in the sfGFP-H2C13 complex in the asymmetric unit. 60

Figure 27. Crystal structure of the sfGFP-repebody (H2C13) complex. 61

Figure 28. Amino acid changes during the affinity maturation of sfGFP-repebody. 62

Figure 29. Metagenomic screening for lipolytic genes from two metagenomic libraries, K2D-FT and K2D. 72

Figure 30. Effect of the enforced transcription system on metagenomic screening. 73

Figure 31. Community analysis of the positive hit sequences. 74

Figure 32. Chromosome vector (ChroV) system in E. coli JM109(DE3) cells. 86

Figure 33. Expression of GFPuv using the ChroV system. 87

Figure 34. SDS page analysis of GFPuv expression in ChroV-GFPuv (a) and pRMT-GFPuv (b). 88

Figure 35. Growth curve between ChroV and pRMT system. 89

Figure 36. Cloning of the β-carotene synthetic gene cluster in the ChroV system. 90

Figure 37. Stability of expression levels of pRMT-GFPuv and ChroV-GFPuv without antibiotics at high... 91

초록보기

 생명체가 수행하는 모든 행동은 다양한 물질들과 세포 내 단백질 또는 화학물질들간의 상호작용에 의해 이루어지며, 이를 통하여 세포의 기능을 조절하며 생명을 유지하고 있다. 이러한 단백질 또는 화학물질들에 대한 단백질 바인더의 개발은 질병의 치료 및 진단에 널리 이용되고 있으며 따라서, 거대 단백질 라이브러리에서 원하는 물질에 대한 단백질 바인더를 개발하기 위해서는 디스플레이 시스템의 이용이 필수적이다. 파아지 디스플레이 기반의 바이오팬닝법과 정량적 효모표면 디스플레이 기반의 유세포 형광분석기술이 현재 가장 널리 사용되고 있는 디스플레이 및 고속 스크리닝기술이며, 이 외에도 다양한 기술들이 개발되고 있다. 그러나 현재까지 개발된 방법들 대부분은 라이브러리로부터 원하는 타깃물질에 대한 바인더 발굴을 위해 반복된 스크리닝 과정을 필요로 하며, 이 과정은 높은 위양성 및 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.

본 연구에서는 단백질 봉입체를 기반으로 하여 단백질 바인더 스크리닝에 소요되는 시간을 획기적으로 단축함과 동시에 위양성을 최소화하여 쉽게 원하는 타깃물질에 대한 단백질 바인더를 탐색 할 수 있는 새로운 시스템을 개발하였다. 일반적으로 단백질 봉입체는 변성단백질의 단순 침전물로 인식되고 있으나 일부 아밀로이드 펩타이드 또는 바이러스성 단백질들은 섬유성 단백질 응집체를 형성하며 이 단백질들과 융합되어 발현된 단백질들이 단백질 봉입체 형태로 생성되면서도 단백질 고유의 생화학적 특성을 상당부분 유지하는 활성형 단백질 입자임이 보고되어 있다. 본 연구에서는 활성형 단백질 입자인 셀룰로모나스 피미 유래의 CBD단백질을 디스플레이 담체로 사용하여 펩타이드 또는 효소를 디스플레이 한 결과, 세포 내에서 20-30 nm 크기의 나노입자 형태의 디스플레이 담체를 형성하며, 디스플레이한 단백질들이 고유의 생화학적 특성을 상당부분 (~30%) 유지하는 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 CBD단백질에 모델 단백질 바인더인 리피바디를 디스플레이 한 결과 한 봉입체 당 106 이상의 단백질 바인더가 세포 내에 활성형으로 발현되어 안정적으로 디스플레이 됨을 확인하였다.

다른 세포 표면에 바인더를 디스플레이 하는 시스템과는 달리 본 시스템은 세포 내 단백질 봉입체에 단백질 바인더가 디스플레이 되어 있으므로, 외부 거대 타깃 물질들을 세포 내부로 인가하여 바인더와 상호작용을 유발시키기 위한 방법이 필요 했으며 이에 본 연구에서는 세포 표면에 균열을 형성시키는 방법으로 단백질간 상호작용을 유도 했으며, 이를 "세포 내 입자 디스플레이" 라고 명명하였다. 본 연구에서 개발한 세포 균열 방법을 이용하면 외부 타깃 물질은 세포 내부로 쉽게 접근 가능하면서도, 세포 내 바인더가 디스플레이 되어 있는 단백질 봉입체와 유전 정보는 안정적으로 유지되는 특징을 가진다. 즉, 형광 라벨링된 외부 타깃이 균열 세포 내로 인가되어 바인더와 상호작용 하게 되고 해당 세포를 유세포 형광분석기를 이용하여 선택적으로 선별, 회수하는 새로운 방식의 스크리닝 시스템이다. 이 시스템을 이용하면 낮은 위양성 비율로 거대 라이브러리에서 원하는 타깃에 대한 바인더 단백질을 고감도로 선별할 수 있음을 확인하였다. 본 디스플레이 시스템을 실제 라이브러리에 적용하여 여러 종류의 타깃들 (슈퍼폴드 녹색 형광 단백질, 인터루킨-6, 플루오레세인, 덱스트란)에 대해 바인더 단백질 스크리닝을 수행한 결과, 3라운드 이내의 스크리닝만으로도 각 타깃에 대한 바인더를 성공적으로 발굴할 수 있었으며, 타깃의 동일 에피토프에 결합하는 바인더 첨가를 통한 경쟁적 스크리닝을 통해 결합력이 더 강한 바인더를 찾는 친화도 성숙도 쉽게 가능함을 확인하였다. 이러한 스크리닝의 모든 과정은 3일 내에 수행되어 다른 디스플레이 방법들에 비해 현저히 효율적인 방법임을 증명해 보였다.

본 연구의 세포 내 입자 디스플레이 시스템의 확장을 위한 관련된 기술 개발 연구도 부가적으로 수행하였다. 그 중 하나로서, 원하는 타깃의 바인더가 불용성인 경우, 샤페론의 도움으로 불용성 바인더를 활성형으로 전환하여 타깃과 결합할 수 있는 바인더를 찾는 연구에 세포 내 입자 디스플레이 시스템을 적용하고자 하였다. 이에 메타게놈에서 다양한 샤페론들을 찾고자 하였으며, 메타게놈의 유전자 발현을 획기적으로 향상시킬 수 있는 "강제전사" 기술을 개발하였다. 또 다른 연구로서, 세포 내 입자 디스플레이의 핵심 부품인 CBD단백질 융합 플라스미드를 대장균 내에서 안정적으로 발현하기 위해 F' 플라스미드 기반의 발현 시스템인 ChroV 시스템을 구축하였다. 현재 세포 내 입자 디스플레이 시스템은 본 연구에서 진행된 단백질, 케미컬 타깃 외 펩타이드 타깃 등에 대한 바인더를 탐색하는 연구 외에도 레피바디 이외의 단백질 바인더 (안티바디, 비항체 단백질, 펩타이드 등)를 이용한 실험을 수행하고 있으며, 향후 이렇게 발굴된 바인더를 바이오센서 개발 등에 적용 할 계획이다.

본인은 해당 연구를 통해 세포 내 단백질 봉입체를 이용 고효율 디스플레이 및 바인더단백질 고속 탐색 기술을 개발하였다. 이러한 세포 내 입자 디스플레이 시스템이 강제전사 시스템과 ChroV 시스템과 같은 기술들과 효과적으로 결합되면, 단백질바인더 부분이 다양한 펩타이드, 다른 바인더 단백질 또는 항체 등으로 확장되어 형광 표지된 표적 단백질, 효소, 케미컬, 보제 등에 대해 새로운 기능을 가진 바인더들 개발에 효과적으로 이용될 수 있으며, 향후 생명공학 산업에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대하고 있다.

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