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Title Page

Contents

Abstract 6

1. Introduction 8

2. Materials and Methods 12

2.1. Strains and plasmids 12

2.2. Primers 12

2.3. Genetic manipulation 18

2.4. Culture conditions 20

2.5. Instrumental analysis 21

3. Results and Discussion 23

3.1. Point mutation of GAL83 and deletion MIG1 in S. cerevisiae 23

3.2. Galactose induction test for genetic circuit in DGM 25

3.3. Construction genetic circuit by CRISPR/dCas9-Mxi1 in yeast-1 28

3.4. Construction genetic circuit by CRISPR/dCas9-Mxi1 in yeast-2 31

3.5. Construction genetic circuit by CRISPR/dCas9-Mxi1 in yeast-3 34

4. Conclusions and Discussions. 38

References 39

Figure captions 41

요약 45

List of Tables

Table 1. The list of yeast strains and plasmids used in this study 13

Table 2. The list of primers used in this study 16

Table 3. The list of PDC5 gRNA target sequence for CRISPR/dCas9 35

List of Figures

Figure 1. A concept of the genetic circuit design. Before galactose is induced(Figure. 1A),... 11

Figure 2. Batch fermentation results of D452-2, DM, DGM grown in 50ml of YPDG medium... 24

Figure 3. Transformation pRS426Gal1p_yeGFP of D452-2, DGM and Batch fermentation results. 26

Figure 4. Transformation pRS426Gal1p_yeGFP of DGM and Batch fermentation results. Strains... 27

Figure 5. Batch fermentation result of (A) DC2, (B) DCNT grown in 50ml of YPDG(2%... 29

Figure 6. Batch fermentation result of (A) MGC1, (B) MGC2, (C) MGC3, (D)MGCNT grown... 30

Figure 7. Batch fermentation result of (A) D452-2, (B) DGM and (C) DGMA grown in 50ml... 32

Figure 8. Batch fermentation result of (A) AGC1, (B) AGC2, (C) AGC3, (D) AGC4 and... 33

Figure 9. Batch fermentation result of (A) BGC1, (B) BGC2, (C) BGC3, (D) BGC4 and (E)... 36

Figure 10. Batch fermentation result of (A) BGC1, (B) BGC2, (C) BGC3, (D) BGC4 and (E)... 37

초록보기

이 연구의 목적은 홍조류의 주요 단당인 갈락토스를 활용하여, 대사 능력이 향상된 돌연변이 효모 Saccharomyces cerevisiae D452-2 에 유전자 회로를 적용하는 것임. Saccharomyces cerevisiae 에서 galactose inducible system 을 작동시키기 위해서는 catabolite repression 이 억제가 되어야 함. 이 문제를 해결하기 위해 catabolite repression 관련된 Snf1 kinase 에 β unit 중 하나를 인코딩하는 GAL83 유전자 (G703A)를 point mutaion 시키고, CRISPR/Cas9 을 이용하여 MIG1 유전자를 삭제 하였음. 발효 결과, DGM 균주는 D452-2 균주와 달리 포도당과 갈락토오스를 동시에 소모하였고, 이를 통해 MIG1 이 제거된 균주에서 catabolite repression 이 억제됨을 확인함. 그리고 GFP 분석을 수행하여 갈락토스가 유전자 스위치를 작동시키는 유도제로서 사용될 수 있음을 입증 하였음. 이러한 GFP 결과는 DGM 이 빠르게 포도당과 갈락토스를 동시에 대사 할 수 있으며, 갈락토스가 유도 제로 사용될 수 있음을 나타냄. 우리는 또한 target DNA 서열을 차단하고 DGM 에서 galactose 에 의해 유도 된 GAL 프로모터 기반 CRISPR / dCas9 시스템을 구축 하였음. 이를 통하여, 효모 Saccharomyces cerevisiae 에서 galactose 기반 CRISPR/dCas9 유전자 회로를 개발하고자함.

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