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Title Page

Contents

Abstract 9

1. Introduction 11

2. Materials and Methods 14

2.1. Screeniug Strain 14

2.2. Candida tropicalis bioconversion 15

2.2.1. Seed culture 15

2.2.2. Pre culture (Growth phase) 15

2.2.3. Main culture (Growth phase) 15

2.2.4. Main culture (Conversion phase) 16

2.3. Preparation of fatty acid and dicarboxylic acid 18

2.4. GC-MS analysis of fatty acid and dicarboxylic acid 19

2.5. Extraction of bioconversion azelaic acid 20

2.6. Real time PCR 21

2.6.1. Primer 21

2.6.2. RNA extraction, cDNA synthesis and Real-time PCR 21

3. Results 24

3.1. Comparison of ATCC 20962 Candida tropicalis and CPJ1 to bioconvert nonanoic acid to azelaic acid 24

3.2. Optimize substrate feeding rate 28

3.3. Optimize initial glucose concentration 30

3.4. Production of azelaic acid at 2.5L scale with yeast extract during fermentation to increase fermentation time 33

3.5. Production of azelaic acid at 2.5 L scale with controlled NaOH concentration to reduce volume growth 35

3.6. Extraction of bioconversion azelaic acid 37

3.7. Real time PCR 39

4. Discussion 40

5. References 42

국문요약 46

List of Tables

Table 1. primer 23

Table 2. Comparison of ATCC 20962 Candida tropicalis and CPJ1 to bioconvert... 27

Table 3. Comparison of Conditions of Different Glucose Concentrations of CPJ1 to... 32

List of Figures

Fig 1. Substrate-resistance strain screening schematic 14

Fig 2. Process for producing azelaic acid by Candida tropicalis 17

Fig 3. Preparations of nonanoic acid and azelaic acid 19

Fig 4. Bioconversion of nonanoic acid to azelaic acid by ATCC 20962 Candida... 25

Fig 5. Bioconversion of nonanoic acid to azelaic acid by CPJ1 Candida tropicalis. 26

Fig 6. To optimize substrate feeding rate Bioconversion of nonanoic acid to azelaic... 29

Fig 7. To optimize substrate feeding rate Bioconversion of nonanoic acid to azelaic... 31

Fig 8. Bioconversion process applying 200g / L of 25ml yeast extract every 60 hours... 34

Fig 9. Result of fermentation applying all improved conditions. Bioconversion of... 36

Fig 10. Bioconversion azelaic acid recovered by the extraction process 37

Fig 11. Extracted bioconversion azelaic acid GC/MS data 38

Fig 12. Real-time PCR result. Time 1: Before induction, 2: after induction, 3: after... 39

초록보기

Candida tropicalis 를 이용하여 nonanoic acid로부터 azelaic acid로 효율적으로 생물전환시키기 위해 다양한 조건으로 배양 실험하였다. 기질의 저항성을 높이기 위한 균주 스크리닝을 통하여 CPJ1 균주로 개량하여 기존의 ATCC 20962 균주보다 생산속도와 생산량을 3.47 배 증가시켰다. 이후, Azelaic acid의 생산을 증가시키기 위해 여러 배양조건에서 실험하였다. 기존의 기질의 간헐적 투여방식을 연속적으로 주입하여 2.5L 바이오 리액터에서 유가식배양을 실험하였다. 그 결과 Dry cell weight의 감소량과 azelaic acid의 생산량을 측정하여 기질 투여 속도를 0.4 g/L-h로 최적화 하였다. 초기의 포도당의 양을 늘려 세포의 양을 늘려 전환시키기 위하여 다양한 초기 포도당 농도로 실험을 진행하였고 포도당 농도 40g/L에서 많은 세포의 양과 높은 생산량을 보였다. 발효시간의 증대에 따라 배지의 부피 증가, 배지성분의 고갈에 따른 세포 사멸로 배지가 역류하는 문제점을 발견하였다. 이를 위해 60시간마다 200 g/L의 Yeast Extract 25ml을 투여하였고 부피의 증가량을 줄이기 위하여 NaOH의 농도를 2N농도에서 5N 농도로 증가하여 실험을 진행하였다. 그 결과 97 g의 azelaic acid를 생산하였고 10.7배의 생산량 증가와 2.33배의 생산속도 증가시켰다. 배양액을 회수하여 순도 85%, 64.5%의 수율로 추출을 진행하였다. 또한 바이오전환공정 중의 발현되는 특정 CYP유전자를 발견하였다. 특정 CYP를 균주에 도입하는 것은 azelaic acid의 전환율을 증가시키는 중요한 요인이 될 것이다.

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