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Title Page

ABSTRACT

Contents

I. Introduction 15

II. Materials and Methods 24

1. Materials 24

1.1. Bacterial strains and cloning 24

1.2. Enzymes and carbohydrate samples 26

2. Methods 27

2.1. Cloning of BtBE 27

2.2. Determination of enzyme characteristics 30

2.3. Production of glycogen-like particles by the one-pot enzymatic reaction of Amylosucrase and glycogen branching enzymes 35

2.4. Chemical structure of glycogen-like particle 38

2.5. Statistical analysis 41

III. Results and Discussion 43

3.1. Cloning and expression of the glycogen branching enzyme from Bifidobacterium thermophilum 43

3.1.1. Cloning of BtBE gene 43

3.1.2. Nucleotide sequence analysis of the BtBE 50

3.1.3. Expression and purification of pET-24a(+)-BtBE 54

3.2. Biochemical properties characterization of BtBE 57

3.2.1. Effect of pH on BtBE activity 57

3.2.2. Long-term thermostability of BtBE 59

3.2.3. Effect of temperature on BtBE activity 61

3.2.4. Short-term thermostability of BtBE 63

3.2.5. Long-term thermostability test of BtBE with optimum condition 65

3.2.6. Determination of minimal DP as substrate 69

3.3. Enzymatically synthesized glycogen-like particles 72

3.3.1. Determination of sucrose consumption time during the simultaneous reactions of ASase and GBE 72

3.3.2. Measurement of production yields of powdered glycogen like-particles 74

3.3.3. Determination of molecular weight of glycogen like particlesby substrate concentration 76

3.3.4. Determination of branched chain length distribution of glycogen like-particles 82

IV. Conclusions 87

V. References 89

국문초록 96

List of Tables

Table 1. Production process of glycogen in vitro/ in vivo 23

Table 2. Enzyme purification table of BtBE in E. coli grown in 1-L culture 55

Table 3. kd(deactivation rate constant) and t1/2 (half-life parameter) for BtBE[이미지참조] 68

Table 4. Production yields of powdered glycogen like-particles 75

Table 5. Weight-average molecular weight, gyration radius, apparent density and polydispersity of GLPs produced by... 80

Table 6. Weight-average molecular weight, gyration radius, apparent density and polydispersity of GLPs produced by... 81

Table 7. Branch chain length distribution of GLPs (treated with NpAS + RoBE) 85

Table 8. Branch chain length distribution of GLPs (treated with NpAS + BtBE) 86

List of Figures

Figure 1. Simultaneous reaction of ASase and GBE,◇, Glucose attached by amylosucrase; ◇, Glucose chain attached by...[이미지참조] 22

Figure 2. Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from Bifidobacterium thermophilum 46

Figure 3. After freeze-thawed the PCR mixture, agarose gel electrophoresis of amplified... 47

Figure 4. Vector map of recombinant pET-24a(+)-BtBE designed and depicted SnapGene 48

Figure 5. Agarose gel electrophoresis of restriction enzyme treated pET-24a(+)-BtBE... 49

Figure 6. The nucleotide and amino acid sequences of glycogen branching enzyme from... 53

Figure 7. The SDS-PAGE analysis of the BtBE protein purified by Ni-NTA affinity column. 56

Figure 8. Effect of pH value and buffer composition on the relative activity of BtBE... 58

Figure 9. Long-term thermostability profiles of BtBE in various pH buffer systems. The BtBE was pre-incubated at 35℃ (A),... 60

Figure 10. Effect of reaction temperature on enzyme activity of BtBE. The reaction for... 62

Figure 11. Short-term thermostability profiles of BtBE. The BtBE solution in 50... 64

Figure 12. Long -term thermostability test of BtBE with 50 mM Tris-HCl (pH 7.0). BtBE was pre-incubation at (A) 30℃; (B)... 67

Figure 13. Determination of minimal DP as substrate. DP was used for each chain... 71

Figure 14. Determination of sucrose consumption time during the simultaneous reaction of enzymes. Using various enzyme... 73

Figure 15. HPSEC-RI-MALS chromatograms of GLPs produced by the NpAS+RoBE combination. (A) RI (chromatograms)... 78

Figure 16. HPSEC-RI-MALS chromatograms of GLPs produced by the NpAS+BtBE combination. (A) RI (chromatograms)... 79

Figure 17. Branch chain length distribution of GLPs produced by (A) the NpAS+RoBE combination; (B) the NpAS+BtBE... 84

초록보기

당전이 효소군에 속하는 글리코겐 분지 효소(GBE)는 식물 및 박테리아 유기체에서 글리코겐의 생합성을 위하여 사용된다. GBE의 주요 반응패턴은 α-(1,4)-글루칸 사슬의 α-(1,4)-글리코사이드 결합을 가수 분해하고, 동시에 올리고머 사슬 분획을 다른 글루칸 사슬로 이동시켜 α-(1,6)-글리코사이드 결합을 통해 새로운 글루칸 분지를 형성하는 것이다. 글리코겐은 식품, 화장품 및 제약 산업에서 새로운 기능성 물질로 활용될 수 있지만 동물, 박테리아 및 식물에서 천연 글리코겐만을 추출하는 것에는 많은 어려움이 있다. 우리는 새로운 GBE의 발현 시스템을 개발하였다. 이 연구에서는 GBE와 아밀로수크라제의 조합 반응에 의한 생체 촉매 합성 글리코겐 유사입자(GLP)의 분자량 구조와 특성을 조사했다.

이 연구에서는, Bifidobacterium thermophilum JCM 1207의 GBE 유전자는 대장균에 성공적으로 클로닝 및 발현되었다. Bifidobacterium thermophilum으로부터 유래된 GBE (BtBE)유전자는 2,271개의 뉴클레오타이드로 구성되었고 757개의 아미노산 잔기로 암호화 되어있다. 유전자 분석을 통해 계산된 분자량은 87,040 Da이고, 이는 SDS-PAGE분석에 의해 결정된 분자량인 87 kDa와 일치하였다. 정제된 BtBE의 특이 활성은 0.2 U/mg이었고 세포 추출물의 특이 활성보다 대략 2배 더 높은 것으로 측정되었다. BtBE은 30도의 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)의 완충액이 가장 최적의 조건이었다. 한편, BtBE는 내열성이 우수하여 50도에서 120시간 동안 사전배양한 경우에도 반감기가 1732.87시간으로 측정되었다. BtBE의 효소 반응을 위한 기질의 최소 사슬길이는 DP 9인 것으로 결정되었고 따라서 BtBE는 기질로서 DP 9 미만을 이용할 수 없었다. 아밀로수크라제와 GBE 동시반응에 의해 GLP를 생산할 때 0.3-1 M 수크로즈가 생산시간대비 가장 효과적이다. 기질로서 0.3-1 M 수크로즈를 사용하여 GLP를 생산할 때 생성물 수율은 16.5-42%인 것으로 계산되었다. HPSEC-RI-MALS 시스템을 사용하여 기질 농도 별로 생산한 GLP의 분자량 특성을 측정하였다. NpAS+RoBE 조합으로 생산한 GLP는 기질농도가 증가함에 따라 더 높은 분자량을 나타냈다(9.59 ± 0.41 x 106부터 2.95 ± 0.03 x 107까지 증가하였다). 반면, NpAS+BtBE 조합으로 생산된 GLP는 기질농도가 증가함에 따라 분자량이 더 낮아졌다. (1.06 ± 0.11 x 107 부터 4.85±0.21 x 105까지). GLP의 분지사슬분포는 HPAEC-PAD 시스템에 의해 결정되었다. GLP는 GBE에 상관없이 기질 농도가 증가함에 따라 검출 가능한 사슬 길이가 감소되었다. 또한, NpAS + RoBE 조합에서는 주로 DP 8과 9가 생산되었고, NpAS + BtBE 조합에서는 주로 DP 6이 생산되었다.

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