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표제지

목차

ABBREVIATIONS 9

국문요약 11

I. 서론 (Introduction) 15

II. 실험 방법 (EXPERIMENTAL) 23

1. 시약 및 기기 23

2. Ultra-performance liquid chromatography 25

3. UPLC-ESI-MS/MS 분석조건 26

4. 혈청 검체 27

5. 실험방법 27

1) 표준 용액 제조 및 검량선 작성 27

2) 추출조건 확립 28

3) 밸리데이션 29

4) 혈청 시료 분석 31

5) 통계 분석 33

III. 결과 및 고찰 (RESULTS and DISCUSSION) 34

1. 최적분석조건 확립 34

2. 밸리데이션 39

3. 혈청 시료 중 대사체의 정량 42

4. 통계 분석 47

1) PLS-DA and VIP score 47

2) Heatmap visualization and random forest 48

IV. 결론 (CONCLUSION) 50

REFERENCES 84

ABSTRACT 92

표목차

Table 1. MS/MS parameters of BAs, OFAs, SPLs and PLs 52

Table 2. Comparison of quantification parameters to our study 54

Table 3. Calibration range, linearity, limit of detection and limit of quantification based... 55

Table 4. The intra-day precision and accuracy based on standard spiked bovine serum albumin 56

Table 5. The inter-day precision and accuracy based on standard spiked bovine serum albumin 58

Table 6. Recovery of BAs, OFAs, SPH, PLs spiked bovine serum albumin 60

Table 7. Quantification of 37 metabolites on serum in heathy subjects and asthmatic patients 61

그림목차

Fig. 1. Molecular structure and empirical formula for 37 targeted metabolites. The peak... 63

Fig. 2. The ESI-MS/MS spectra of bile acids, sphingolipids, omega fatty acids and... 67

Fig. 3. The total ion chromatogram (TIC) of 37 BAs, OFAs, SPLs and PLs on different... 71

Fig. 4. Comparison of the extraction efficiency of group specified target compounds... 72

Fig. 5. Comparison of the extraction efficiency of group specified target compounds... 73

Fig. 6. UPLC-MS/MS chromatograms of 37 metabolites in MRM mode. The peak... 74

Fig. 7. Bar diagram of normalized concentration of 37 metabolites from human healthy... 76

Fig. 8. PLS-DA score plot (A) and correlation loading plot of the predictive component... 79

Fig. 9. UPLC-MS/MS identification of 37 metabolites of both asthma and control.... 80

Fig. 10. VIP score of PLS-DA analysis. VIP, variable importance in projection. 81

Fig. 11. Heat map visualization of top 9 metabolite that having statistical significance;... 82

Fig. 12. Random forest results for the asthma and control. 83

초록보기

생체내 대사물인 담즙산, 오메가 지방산, 스핑고지질과 인지질은 대사성 질환, 알러지성 질환, 자가면역 질환 등 다양한 염증반응과 관련된 것으로 보고되고 있다. 천식도 일종의 염증반응으로 볼 수 있으며, 이 때 천식환자의 경우, '정상인과는 다른 면역 체계의 교란으로 효소의 활성화과정이 정상인과는 차별성이 있을것이다'는 가정하에 천식환자의 혈청에서는 담즙산, 오메가 지방산, 스핑고지질 및 인지질 등의 혈청 프로파일이 정상인과는 다름을 이용하여 질병의 예방과 진단 및 치료과정의 모니터링이 가능할 것으로 여겨졌다. 따라서 천식 및 염증반응과 관련된 대사체들의 동시 정량분석법 개발의 필요성이 대두되고 있다.

현재까지 다양한 대사체들의 분석법이 개발되고 있으며, GC의 경우 복잡한 전처리인 유도체화 과정이 꼭 필요하거나 적용가능한 대사물이 휘발성이고 비극성이어야 유리하다는 한계가 있고, LC 사용시 UV나 형광검출기 등 검출기 종류에 따라서 감도가 낮거나 유도체화가 필요한 단점이 있다. 최근 우수한 분리능력을 가진 초고성능 액체크로마토그래피 이중질량분석기 (UPLC-MS/MS)의 발달에 힘입어 혈청, 혈장, 소변, 조직, cell 등 다양한 생체대사물들의 감도높게 분석되고 있다.

현재까지 본 연구의 분석대상으로 선정된 천식 관련 37 종 생체대사물들은 물질들 간의 극성의 차이가 크며 생체 내 농도 범위 또한 다양하여 이들의 혈청 중 동시 정량분석법은 국내에서 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 UPLC-MS/MS를 이용한 multiple reaction monitoring (MRM) 모드를 사용하여 담즙산 6 종, 오메가 지방산 5 종, 스핑고지질 2 종 그리고 인지질 24 종을 포함한 총 37 종의 대사체를 신속하게 동시 정량하는 분석법을 개발하였다.

총 10 가지의 추출용매에 대한 회수율 비교실험을 통해 동시 추출을 위한 최적의 추출용매로는 butanol : methanol (1:1, v/v)을 선택하였다. 4 가지 이상의 C18 컬럼의 비교분석을 통하여 37 종 동시 분석을 위한 최적의 분석 컬럼으로는 Acclaim RSLC120 C18을 선정하였다. 다양한 이동상의 조건을 비교 검토한 결과 이동상 A의 조성이 5% acetonitrile과 5% methanol을 포함한 수용액이고, 이동상 B의 조성이 2.5 mM ammonium acetate가 포함된 MTBE : acetonitrile : methanol (10 : 20 : 70, v/v/v)이었을 때 최적 조건임을 확인하였다. 37 종의 대사물에 대한 MRM이온과 최적 MS/MS 조건을 각각 선정하였다.

직선성을 가진 정량범위와 정량한계(LOQ)는 담즙산 6 종에서 0.01 ~ 20.0 µg/mL (LOQ, 0.01 ~ 0.04 µg/mL), 오메가 지방산 5 종에서 0.01 ~ 20.0 µg/mL (LOQ, 0.01 ~ 0.2 µg/mL), 스핑고지질 2 종에서 0.002 ~ 2.0 µg/mL (LOQ, 0.002 ~ 0.005 µg/mL), 그리고 인지질 24 종에서는 0.001 ~ 5.0 µg/mL ( LOQ, 0.004 ~ 1.0 µg/mL)로 매우 우수한 정량한계를 보였다.

밸리데이션 과정에서 분석법에 대한 정확성과 정밀성은 37 종의 분석대사물질에 대해 일내(n＝5) 정확성과 정밀성은 90.1 ~ 105.3% (0.8 ~ 8.9%) 그리고 일간(n＝4) 정확성과 정밀성은 93.5 ~ 103.8% (1.7 ~ 9.0%)의 우수한 결과를 보였다. 본 연구에서 개발한 분석법에 대한 회수율은 docosapentaenoic acid(DPA)를 제외한 모든 물질에서 90.7 ~ 108.2%와 상대 표준편차 (0.2 ~ 5.6%)의 우수한 회수율을 보임을 확인하였다.

실제 임상시료에 적용하여 천식환자 (n＝25)와 건강한 정상군 (n＝25)의 혈청 에서 37 종 대사물의 농도를 정량하였으며 그 결과를 통계 처리하여 비교하였다. 주성분 분석과 부분 최소제곱 판별분석을 이용하여 두 그룹간 농도 차이에 대한 유의성을 확인한 결과, 37 종 중 17 종의 대사체에서 p-value 〈 0.05 에서 유의성을 가지는 것을 확인하였다. 특히 혈청 중 24 종 인지질의 농도는 lysophosphatidylcholine (LPC) 16:0, phosphatidylethanolamine (PE) 36:3, PE 36:2 그리고 PE 36:1 4 종을 제외한 20 여 종의 분석 타겟 성분들의 농도가 천식환자인 경우 정상인보다 유의성 있게 높은 농도롤 보였다.

본 연구에서 새로 개발한 분석법은 이전에 보고된 논문의 단점을 극복하여 1) 기존의 추출법과 비교하여 아주 적은 양 (수 십 µL)의 용매와 시료를 사용하였으며, 2) 극성이 강한 작용기가 붙어있는 지질계열을 분리함에 있어서 고가의 hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) 또는 metal free 컬럼이 아닌 널리 사용되는 C18 컬럼을 사용하였고, 3) 37 종의 동시분석에 가장 효율적인 최적 이동상 조건을 확립하였으며, 이 방법을 통하여 4) 국내에서는 최초로 건강한 한국인과 천식환자의 혈청 중 대사물의 농도에 관한 비교 데이타를 얻었다.

본 연구에서는 건강한 사람과 천식환자의 혈청으로부터 37 종의 대사체를 20 분 이내에 신속하게 정량 가능한 UPLC-MS/MS 를 사용한 동시 정량분석법을 개발하였다. 통계를 적용하였을 때 유의성이 있게 두 그룹을 구별하는 것으로 확인된 물질은 17 종의 대사체이다. 이 동시분석법은 임상적으로 진단이 애매모호한 천식발병의 예방적 지표를 나타내는 생체물 프로파일로, 진단의 유용한 바이오마커로, 다른 용도로는 세포 내 조성과 생체 대사과정의 조절기능을 심화 연구하는 플랫폼 형성을 위한 기반이 되는 유용한 도구로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

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