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Title Page
Contents
Abstract 11
1. Introduction 14
1.1. Ras 14
1.2. Ras - expression and mechanism of action 17
1.3. Downstream effectors of Ras 20
1.4. Mutation of Ras 23
1.5. Current Ras targeting strategies for cancer treatment 25
1.5.1. Disruption of membrane association 25
1.5.2. Ras activation inhibitors (Figure 7) 27
1.5.3. Kinase inhibitors targeting Ras effector pathways 29
1.6. Novel mechanism for Ras inhibition 32
1.6.1. Destruction complex in Wnt/β-catenin pathway 32
1.6.2. Ras degradation mediated by destruction complex 34
1.6.3. KYA1797K - novel compound presented inhibition against CRC 36
2. Materials and methods 38
2.1. General methods for synthesis and chemical analysis 38
2.2. Screening workflow 40
3. Chemistry 43
3.1. Derivative design 43
3.1.1. Previous work - optimization to KYA1797K 43
3.1.2. Scope of structural modification 43
3.2. General synthetic methods 46
3.3. Synthesis 48
3.3.1. Synthesis of rhodanine intermediates 1 48
3.3.2. Synthesis of 2-thiohydantoin intermediates 3 49
3.3.3. Synthesis of 2,4-dioxothiazolidine intermediates 5 50
3.3.4. Synthesis of 2,4-dioxothiazolidine intermediates 6, 7, 9 52
3.3.5. Synthesis of rhodanine intermediates 10. 56
3.3.6. Synthesis of aldehyde intermediates 11 57
3.3.7. Synthesis of aldehyde intermediates 14 59
3.3.8. Synthesis of KYA1797K derivatives 15 62
3.3.9. Synthesis of KYA1797K derivatives 16 - 21 63
3.3.10. Synthesis of KYA1797K derivatives 22 - 25 64
3.3.11. Synthesis of KYA1797K derivatives 26 - 28 66
3.3.12. Synthesis of KYA1797K derivatives 29, 30 68
4. Results 70
4.1. TOPflash reporter gene assay and structural optimization 70
4.2. Western blotting 83
4.3. Antitumor effect of 27a 87
4.4. Binding site identification of 27a 90
5. Conclusion and discussion 93
6. Experimental section of chemistry 98
6.1. Compound property and spectral analysis data for (1) 98
6.2. Compound property and spectral analysis data for (2, 3) 99
6.3. Compound property and spectral analysis data for (4, 5) 101
6.4. Compound property and spectral analysis data for (6 - 9) 104
6.5. Compound property and spectral analysis data for (10) 109
6.6. Compound property and spectral analysis data for (11) 110
6.7. Compound property and spectral analysis data for (14) 111
6.8. Compound property and spectral analysis data for (15) 112
6.9. Compound property and spectral analysis data for (16 - 21) 117
6.10. Compound property and spectral analysis data for (22 - 25) 126
6.11. Compound property and spectral analysis data for (26 - 28) 137
6.12. Compound property and spectral analysis data for (29, 30) 148
7. References 153
8. Appendices 168
8.1. TOPflash reporter gene assay full results of (15) 168
8.2. TOPflash reporter gene assay full results of (16 - 21) 169
8.3. TOPflash reporter gene assay full results of (22 - 25) 171
8.4. TOPflash reporter gene assay full results of (26 - 28) 174
8.5. TOPflash reporter gene assay full results of (29, 30) 176
9. Abstract in Korean 178
Figure 1. Global colorectal cancer incidence and mortality in 2020 15
Figure 2. Ras mutation in cancer 16
Figure 3. Ras activation by receptor tyrosine kinase 19
Figure 4. Downstream effectors of Ras 22
Figure 5. Frequency of Ras mutation in cancers 24
Figure 6. Farnesyltransferase inhibitors 26
Figure 7. Ras direct targeting compounds 28
Figure 8. Downstream effector kinases inhibitors 31
Figure 9. p-catenin regulation by destruction complex 33
Figure 10. Sequential degradation of β-catenin and Ras by destruction complex 35
Figure 11. KRAS/APC mutations in cancers (upper) and gene mutation ratio in colorectal cancer (lower) 37
Figure 12. Compound screening workflow 42
Figure 13. Previous lead optimization and modification strategy of KYA1797K 45
Figure 14. Overall synthetic scheme of derivatives 47
Figure 15. TOPflash assay results of (15) 71
Figure 16. TOPflash assay results of (16 - 21) 73
Figure 17. Optimization study on A and D part 77
Figure 18. TOPnash assay results of (22 - 25, 29) 79
Figure 19. TOPflash assay results of (26 - 28, 30) 80
Figure 20. Functional group optimization in D part 82
Figure 21. Western blot analysis of 15b, 15c, 15i, 16c, 16d 84
Figure 22. Western blot analysis of 24a, 26a, 27a, 27b 86
Figure 23. Colony formation inhibition assay on SW480 88
Figure 24. Inhibition of 27a on CRC patient derived tumor organoid formation 89
Figure 25. In silico model of compound-Axin binding 91
Figure 26. Fluorescence spectrometry for 27a target validation 92
Figure 27. Trials for solubility improvement and proposed moieties for further study 97
Scheme 1. Reagents and conditions. 48
Scheme 2. Reagents and conditions 49
Scheme 3. Reagents and conditions 50
Scheme 4. Reagents and conditions (a) triphenylphosphine, di(isopropyl)azodicarboxylate, tetrahydrofiiran (THF), 60 ℃, 16 hr; (b) di(isopropyl)ethylamine (DIPEA), acetonitrile, 0 ℃... 52
Scheme 5. Reagents and conditions (a) triphenylphosphine, di(isopropyl)azodicarboxylate, tetrahydrofuran (THF), 60 ℃, 16 hr; (b) di(isopropyl)ethylamine (DIPEA), acetonitrile, 0 ℃... 56
Scheme 6. Reagents and conditions (a) K₂CO₃, tetrakis(triphenylphosphine)palladiuni(0) (Pd(PPh₃)₄), EtOH/toluene (1:1), reflux, 16 hr. 57
Scheme 7. Reagents and conditions 59
Scheme 8. Reagents and conditions 62
Scheme 9. Reagents and conditions 63
Scheme 10. Reagents and conditions 64
Scheme 11. Reagents and conditions 66
Scheme 12. Reagents and conditions 68
초록보기
라스 단백질은 저분자 G-단백질군의 한 종류로써, 외부 시그널을 다양한 하위 신호 경로로 연결하는 역할을 한다. 라스는 세포막의 내부에 위치하여 외부 신호 물질 부재 시 비활성화 상태로 존재한다. EGF 를 비롯한 생장 인자가 외부 신호로써 도입되면, 이로 인한 막 결합 수용체 티로신 카이네이즈의 이합체가 형성되고, 이합체 및 Grb2, Sos 의 단백질 복합체에 비활성화 상태의 라스가 결합하여 활성화된다. 활성화된 라스는 Raf, Ral, PI3K 를 비롯한 다양한 하위 세포 신호 전달체계를 활성화시켜 이를 통해 세포의 생장과 분화 등에 지대한 영향을 미친다. 이러한 라스의 기능 때문에, 라스의 활성 조절 기능이 변이에 의해 손실될 경우 세포의 이상 생장에 큰 영향을 미치며, 실제로 많은 종류의 암에서 라스의 변이가 발견되어 왔다.
항암 치료로써 라스 저해제 개발은 라스와 그 기능이 발견된 이래 지속적으로 이루어져 왔다. 하지만 라스의 신호 전달 체계에서의 위치, 기질과의 높은 결합 친화도 및 변이 형태와 기본 형태의 높은 구조적 유사성은 라스를 매우 힘든 약물 표적으로 만들어왔다. 현재 라스가 매개하는 하위 신호를 담당하는 카이네이즈의 표적 약물이 임상 단계에서 효과가 밝혀지고 있으나, 라스의 과작용은 일부 신호 분자가 아닌, 라스가 관여하는 전반적인 신호 전달 체계의 복합적인 과발현을 야기하기 때문에 라스 저해제로서의 궁극적인 해결책이 되기에는 아직 발전의 여지가 많은 상태이다.
최근 연구에선 기존의 라스 저해 메커니즘과 다른 신규한 저해 메커니즘이 발견되었다. 윈트/베타-카테닌 신호전달체계에서 세포 내 베타-카테닌의 조절자로 알려진 파괴 복합체가 라스의 분해해도 작용할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이러한 파괴 복합체에 의한 라스 조절 작용은, 라스와 결합하는 베타-카테닌에 대한 의존성을 보이는 것이 밝혀졌다. 2016 년 학계에 발표된 신규 화합물 KYA1797K 는 언급한 파괴 복합체 안정화를 통한 대장암에서의 함암 효과를 입증하였다.
본 연구에서는 이러한 고유한 메커니즘을 보이는 KYA1797K 의 화학 구조를 기반으로 하여, 개선된 저해 활성을 보이는 신규한 화합물 개발을 위해 구조 변형을 통한 유도체 최적화 및 선별을 진행하였고, 그 결과로 107 종의 선도 물질 기반 신규 유도체를 확보하였으며, 개선된 활성을 보이는 화합물 27a 를 발굴하였다.
연구를 통해 도출된 27a 는 형광 유전자 분석법 및 단백질 면역 블로팅 에서 베타 카테닌과 라스에 대해 선도 물질 대비 개선된 저해 활성을 개선을 보였으며, 대장암 유래 세포인 SW480 과 대장암 환자 유래 장기유사체에 대한 유의미한 생장 저해 효과를 보였다. 또한 형광 분광법을 이용하여 선도 물질과 동일한 파괴 복합체상의 결합 위치를 지니는 것을 확인했을 뿐만 아니라, 더욱 강한 결합 친화도를 보이는 것 또한 확인하였다.
이러한 결과를 종합하여 27a 는 기존의 라스 저해제와 차별화된 작용 메커니즘을 가진 신규한 종류의 화합물로써, 베타-카테닌과 라스의 동시 저해를 통한 대장암 표적 항암제로써의 개발 가능성을 지닌다 말할 수 있다.MARC 보기
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