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ABSTRACT
Contents
1. Introduction 19
1.1. Drug development 19
1.2. 2D vs. 3D culturing 21
1.3. Organ-on-a-chip 25
1.3.1. Lung-on-a-chip 25
1.3.2. Brain-on-a-chip 26
1.3.3. Heart-on-a-chip 28
1.3.4. Liver-on-a-chip 29
1.3.5. Tumor-on-a-chip 30
1.3.6. Multi-organ-on-a-chip 32
1.4. Research objective 34
2. Microfluidic channel lid for interconnection and cultivation of microtissues on a conventional 96-well microplate 38
2.1. Introduction and motivation 38
2.2. Experimental methods 39
2.2.1. 2D cell culture 39
2.2.2. 3D microtissue fabrication 39
2.2.3. Concept and design of microfluidic channel lid 40
2.2.4. Microfluidic channel lid fabrication 43
2.2.5. Experimental set-up for BoP (Body-on-a-plate) 44
2.2.6. Measurement of morphological size of MTs 45
2.2.7. Drug application 45
2.2.8. Viability assay 46
2.2.9. Fluorescence imaging of MTs 46
2.2.10. Statistical analysis 47
2.3. Results 48
2.3.1. HCT116 microtissue 48
2.3.2. Cultivation of 3D MT under the perfusion condition in BoP 49
2.3.3. Drug (5-FU) testing on 3D HCT116 MTs in BoP 53
2.4. Conclusion and discussion 57
3. 96-well format-based microfluidic device for an in vitro multi-organ network: Body-on-achip Ver 1 61
3.1. Introduction and motivation 61
3.2. Experimental methods 63
3.2.1. Microtissue fabrication and cultivation 63
3.2.2. Layout of the microfluidic device 65
3.2.3. Microfluidic device fabrication 66
3.2.4. Experimental set-up for cultivation of multiple 3D in the device 67
3.2.5. Microtissue diameter measurement 68
3.2.6. Microtissue viability assessments 69
3.2.7. Live cell florescent labeling 69
3.2.8. Calcium imaging 70
3.2.9. Cardiac beating frequency 70
3.2.10. Albumin secretion quantification 70
3.2.11. CYP3A4 enzymatic activity 71
3.2.12. Immunofluorescent staining and confocal imaging 72
3.2.13. On-Chip drug testing 73
3.3. Results 74
3.3.1. Microtissues characterization and functionality validation 74
3.3.2. Microfluidic device set-up 80
3.3.3. Suitable maintenance media test in multiple MTs network 81
3.3.4. Anticancer drug screening in tumor network and multiple MT networks 94
3.4. Conclusion and Discussion 99
4. Improvement of 96-well format-based BoC for ease of use and handing MTs: Body-on-achip Ver 2 104
4.1. Introduction and motivation 104
4.2. Experimental method 106
4.2.1. HCT116 microtissue fabrication 106
4.2.2. Schematic and design of the microfluidic platform 106
4.2.3. Fabrication 107
4.2.4. Experimental set-up for culturing MT networks 109
4.2.5. Characterization of HCT116s cultured in the BoC 110
4.2.6. Chemical and reagent 110
4.3. Results 111
4.3.1. HCT 116 MT cultivation 111
4.3.2. Improvement of 96-well format-based BoC 111
4.3.3. Static vs. Perfusion condition cultivation using 96W-BoC device 112
4.3.4. Anticancer drug 5-FU screening experiment 113
4.4. Conclusion and Discussion 116
5. Conclusions & Future work 118
5.1. Conclusion 118
5.2. Future work 121
REFERENCES 122
요약문 128
APPENDIX 130
Figure 1.1. Drug discovery and the development of new medicines 20
Figure 1.2. Schematic representation of the differences between 2D and 3D cell cultures. Note that the... 22
Figure 1.3. Methods available for 3D formation: (A) static suspension; (B) hanging drop methods; (C)... 24
Figure 1.4. Microtissue fabrication using a U-bottom plate. 24
Figure 1.5. Biologically inspired design of a human breathing lung-on-a-chip microdevice. 26
Figure 1.6. (a) Schematic diagram of a three-dimensional brain-on-a-chip with an interstitial level of flow... 27
Figure 1.7. (a) Contractility assay is run using anisotropic layers of myocytes, scale bar＝20 μm. (b)... 29
Figure 1.8. (a) Bioprinting photocrosslinkable GelMA hydrogel-based hepatic construct within the... 30
Figure 1.9. (a) Establishment of BMi microenvironment is shown by staining for osteocalcin (OCN, red)... 32
Figure 1.10. (a) Cardiac and Liver co-culture in a pumpless microfluidic system. (b) A multi-... 34
Figure 1.11. Suggestion of highly efficient drug screening platform with in vitro multi-organ network 36
Figure 2.1. Microfluidic lid device concept from 96-well sealing mat. 38
Figure 2.2. Schematic of microfluidic lid device. (a) Overview of the top and bottom parts combined, (b)... 41
Figure 2.3. (a) Conceptual schematic and (b) cross-section of the 96-well format-based wells connected by... 42
Figure 2.4. Fabrication of the microfluidic channel-containing lid. Preparing 3D printed molds, pouring... 44
Figure 2.5. The integration of the microfluidic channel lid with a peristaltic pump. (a) A picture of... 45
Figure 2.6. Changes in HCT116 MT morphology for 4 days, depending on the number of cell seedings. 48
Figure 2.7. HCT116 MT size change according to the number of HCT116 cells for four days. 49
Figure 2.8. (a) Picture of before and after inserting microfluidic lid device in a 96-well plate strip and (b)... 50
Figure 2.9. Overview and bright-field images showing a microfluidic channel lid capable of 3D cell culture... 50
Figure 2.10. Growth of HCT116 microtissues (MTs) under static and perfusion condition. (a) Bright-field... 52
Figure 2.11. (a) Bright-field images of HCT116 microtissues (MTs) loaded with a multichannel pipette... 54
Figure 2.12. (a) Bright-field and red fluorescence images of 5-fluorouracil (5-FU)-treated HCT116... 56
Figure 2.13. HCT116 culturing test under static and perfusion condition using device. (a) Static condition... 58
Figure 2.14. The fabricated platform connected with a conventional 96-well plate and an enlarged image... 59
Figure 3.1. Inconvenience of microfluidic channel lid due to using a lot of tubing and occurring air bubbles. 61
Figure 3.2. (a) The fabricated 96-well format-based microfluidic platform for multi-organs-on-a chip, (b)... 66
Figure 3.3. Fabrication procedure of the 96-well format-based platform. (a) Alignment of SU-8 and... 67
Figure 3.4. (a) Schematic overview of the gravity-driven media perfusion by tilting, and (b) the... 68
Figure 3.5. Brain microtissue characteristics evaluation. (a) Cortical neuronal brain microtissue (CN-... 75
Figure 3.6. Demonstration of localization of typical proteins in (a) CN-BrMT and (b) HN-BrMT. 75
Figure 3.7. Time-lapse photographs showing the microtissue formation using cardiomyocyte (CM),... 76
Figure 3.8. Characterization of cardiac microtissues (CdMTs). (a) The size of the CdMT according to the... 77
Figure 3.9. Analysis of beating displacement and Ca2+ intensity of CdMT three days after seeding.[이미지참조] 78
Figure 3.10. Changes in LiMT morphology for ten days, depending on the number of cell seedings 79
Figure 3.11. (a) Changes in LiMT size and (b) LiMT ATP according to the number of cells for ten days 79
Figure 3.12. Picture of (a) before and (b) after filling the microfluidic channel with colored dye 80
Figure 3.13. The overall conceptual diagram. Multi-organ network is formed with CN-BrMT, HN-BrMT,... 81
Figure 3.14. Relative diameter of MTs during eight-day cultivation in different media with respect to the... 83
Figure 3.15. ATP of MTs after being cultured in different media for eight days. of (a) CN-BrMT, (b) HN-... 85
Figure 3.16. Beating frequency (BPM) of CdMTs during an eight-day cultivation in five different media. 87
Figure 3.17. Relative albumin secreation of LiMTs during an eight-day cultivation in different media with... 88
Figure 3.18. Relative CYP3A4 of LiMTs in eight-day cultivation in different media with respect to the... 89
Figure 3.19. Immunofluorescent imaging of BrMTs. (a) CN-BrMT cultured in BrMM, (b) CN-BrMT... 90
Figure 3.20. Immunofluorescent imaging of CdMTs (a) cultured in CdMM and (b) cultured in MoMM... 91
Figure 3.21. Immunofluorescent imaging of LiMTs (a) cultured in LiMM and (b) cultured in MoMM... 92
Figure 3.22. Immunofluorescent imaging of TmMTs (a) cultured in TmMM and (b) cultured in MoMM... 93
Figure 3.23. Configuration of MTs in the microfluidic channel, (a) sole tumor network consisting of five... 95
Figure 3.24. Relative diameter of HCT116 MTs with respect to day zero while cultured in a TmMT... 96
Figure 3.25. Relative diameter of TmMT with respect to day zero, and corresponding microscopic images... 97
Figure 3.26. Relative ATP of TmMTs with respect to the control (0 μM of 5-FU), when cultured in the... 98
Figure 3.27. Bright-field images of CN/HN-BrMT, CdMT, and LiMT in the five MTs-network on day zero and... 101
Figure 3.28. CdMT containing 70% iPCS-cardiomyocyte, 15% primary human cardiac ventricular... 102
Figure 4.1. Comparison between BoC Ver 1 and BoC Ver 2 regarding coating, microtissue seeding, and... 105
Figure 4.2. Schematics of the 96-well format Body-on-a-chip (96W-BoC) (a) Overview of the fabricated... 107
Figure 4.3. Fabrication procedure of the 96-well format-based platform. Preparing 3D printing mold,... 109
Figure 4.4. Process of transferring MT from U-bottom plate to 96W-BoC 110
Figure 4.5. Filled with colored dye in microfluidic channel. Reservoirs were designed to match a... 111
Figure 4.6. (a) Experimental set-up in a conventional incubator (5% CO₂, 37℃,〈80% RH) (b) 3D MT... 112
Figure 4.7. Relative diameter of HCT116 MTs with respect to day zero while cultured under the static... 113
Figure 4.8. Growth of HCT116 MTs cultured with 5-flurouracil (5-FU) (a) in the static condition and (b)... 114
Figure 4.9. Viability of the HCT116 MTs treated by 5-FU, while cultured (a) in the static and (b) the... 115
Figure 4.10. Irinotecan's metabolic processes in the liver 117
초록보기
약물 하나를 개발하기 위해서는 수 많은 시간과 비용이 발생한다. 하지만 많은 투자를 하고 있음에도 불구하고 약물 개발에 있어 성공률은 높지 않다. 이는 약물 개발 단계에서 임상시험 전에 전임상 시험 단계를 거치는데 이 때 후보약물 선별에 있어 판별 방법이 약물 개발의 진행을 늦추고 있다.
전임상 단계에서는 세포 배양과 동물실험이 진행되는데 세포배양은 플라스틱 디쉬에서 세포를 2차원으로 배양하여 약물에 대한 반응을 테스트한다. 하지만 이러한 방법은 실제 생체와 다른 환경을 나타내어 세포의 특성을 완전히 나타내지 못하며 또한, 세포-세포 간의 상호작용을 통한 약물반응을 알지 못한다. 그리고 후보약물을 판별하는 다른 방법은 동물시험이다. 동물실험은 2차원 세포배양보다는 장기-장기의 상호작용을 통한 반응을 알 수 있으나 사람과 다른 유전자로 인해 동물실험에서 통과된 약물을 임상 시험에서 적용할 때 많은 실패율을 나타내기도 한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 생체 내의 환경을 반영할 수 있는 환경과 인간 유도 만능 줄기세포와 같이 사람 세포를 반영할 수 있는 시스템에서 후보 약물 테스트가 필요하다.
오르간 온 어 칩은 마이크로 사이즈, 적은 투여 약물 용량, 오르간과 오르간 사이의 상호작용 등으로 인해 약물 개발 산업에서 약물을 개발하는데 있어 유망한 도구로 떠오르고 있다. 최근에 인간 유도 만능 줄기세포로 제작된 3 차원 배양기술과 함께 적용되어 후보 약물 판별에 있어 성공률을 높여줄 플랫폼이 활발하게 연구되고 있다. 본 연구에서는 세포-세포 상호작용을 할 수 있는 플랫폼 개발 및 다양한 마이크로티슈 제작과 특성 분석을 하였다.
첫번째 제안하는 플랫폼은 상용화된 96 웰 플레이트를 사용하여 물리적으로 분리된 웰들을 개발한 디바이스를 사용하여 서로 연결해주는 플랫폼이다. 즉, 각 웰에 있는 미디어를 디바이스를 통해 공유하여 공간적으로는 마이크로 오르간들이 떨어져 있지만 유체적으로는 연결되어 있는 플랫폼이다. 정체되어 있는 환경과 디바이스를 사용하여 흐름이 있는 환경에서 대장암 마이크로 티슈를 배양한 결과 흐름이 있는 환경에서의 암세포가 훨씬 크기가 커졌다. 또한 항암제를 (5-FU) 사용하여 약물스크리닝을 한 결과 농도에 따라 암세포의 크기가 달라지는 것을 확인하였다.
두번째 플랫폼은 96 웰 형태를 기초한 미세유체 디바이스이며 5개의 서로 다른 마이크로티슈를 (뇌 피질,해마, 심장, 간, 암) 디바이스 안에서 배양하여 제작한 배지와 원래의 배지를 사용하여 제작한 배지가 원래의 배지만큼 각 마이크로티슈들의 특성을 잘 나타냈음을 확인하였다. 제작한 배지를 사용하여 약물 5-FU 의 존재 유무에 따른 장기들의 반응과 항암효과를 분석하여 확인하였다.
세번째 플랫폼은 두번째 플랫폼의 단점을 보완한 96 웰 형태를 기초한 미세유체 디바이스이다. 제안된 디바이스에서도 암세포 마이크로티슈가 정적인 환경보다 디바이스를 사용한 흐름이 있는 환경에서 더 잘 배양되는 것을 확인하였다. 또한 농도별로 약물 스크리닝을 통해 결과를 통해 흐름이 있는 곳에서 더 항암효과가 있는 것을 확인하였으며 우리 신체처럼 흐름이 있는 환경에서 약물 스크리닝을 해야 함을 보여주었다.
요약하면, 상용화된 플레이트를 사용하여 손 쉽게 각 웰들을 연결할 수 있는 플랫폼과 96 웰 형태의 디바이스에서 6 개의 웰들이 미세유체채널을 통해 서로 상호작용할 수 있는 플랫폼을 개발하였다. 이 연구에서 개발한 플랫폼들은 약물 개발에 있어 전임상 연구와 더 복잡한 멀티 오르간 네트워크 시스템 플랫폼으로 후보약물 평가에 있어 시작점이 되질 바라며, 앞으로 새로운 바이러스가 발현되어 빠른 시일 내에 약물을 개발할 때 후보 약물 평가에서 비용과 시간을 줄 일 수 있도록 평가 방법에 기여하길 바란다.MARC 보기
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