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Title Page

ABSTRACT

Contents

Chapter 1. Introduction 11

Chapter 2. Materials and Method 18

2.1. Cell culture 18

2.2. Exosome isolation 21

2.3. Quantitative reverse transcriptase-PCR (qRT-PCR) 21

2.4. miRNA mimics and anti-miRNA oligonucleotides 23

2.5. Immunoblotting 23

2.6. Cell proliferation assay 24

2.7. In vitro scratch wound assay 24

2.8. Nitric oxide assay 24

2.9. Exosome labeling and uptake into endothelial cells 25

2.10. NGS-based small RNA sequencing 26

2.11. Statistical Analysis 26

Chapter 3. Results 27

3.1. Part I. Vascular smooth muscle cell-derived exosomal microRNAs regulate endothelial cell migration under PDGF stimulation 27

3.1.1. PASMC-Derived Exosomes Affect PAEC Migration under PDGF Stimulation 28

3.1.2. Exosomal miRNA Profile is Regulated by PDGF Signaling 34

3.1.3. PASMC-Derived Exosomes Affect Cellular Levels of miRNA in PAECs 42

3.1.4. Downregulation of miR-1246, miR-182, and miR-486 elicits a pro-migratory effect in vascular cells 45

3.1.5. Exosome-derived miR-1246, miR-182, and miR-486 counteract the effect of exosomes from PDGF-stimulated PASMCs on PAEC migration 55

Chapter 3. Results 58

3.2. Part II. PDGF-stimulated Vascular Smooth Muscle Cells Regulate Endothelial Cell Dysfunction through Exosomal miR-409 58

3.2.1. miR-409 was enriched in exosomes derived from PDGF-stimulated PASMCs 59

3.2.2. PASMC-derived exosomal miR-409 was delivered to PAECs 63

3.2.3. PASMC-derived exosomal miR-409 induces endothelial dysfunction 67

3.2.4. miR-409 transfected PAEC regulate PASMC proliferation in co-culture 79

3.2.5. miR-409 regulates the expression of its target mRNA, LRP8, in PAECs 82

Chapter 4. Discussion 86

Chapter 5. References 91

국문초록 102

List of Tables

Table 1. The list of Primer sequences for qRT-PCR 22

Table 2. PASMC-derived exosomal miRNAs downregulated by PDGF-BB signal from next-... 36

Table 3. PASMC-derived exosomal miRNAs upregulated by PDGF-BB signal from next-... 37

List of Figures

Figure 1. PDGF-stimulated vascular phenotype changes 15

Figure 2. Biogenesis of Exosomes 16

Figure 3. miRNA biogenesis 17

Figure 4. Human primary pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) 19

Figure 5. Human primary pulmonary artery endothelial cells (PAECs) 20

Figure 6. Exosomes secreted by platelet-derived growth factor (PDGF)-stimulated pulmonary... 30

Figure 7. Expression of miRNAs in exosomes secreted by PASMCs is affected by PDGF... 38

Figure 8. Levels of miR-1246, miR-182, and miR-486 in PAECs are affected by treatment with... 43

Figure 9. Downregulation of miR-1246, miR-182, and miR-486 promotes PAEC migration.... 47

Figure 10. Downregulation of miR-1246, miR-182, and miR-486 promotes PASMC migration.... 51

Figure 11. miR-1246, miR-182, or miR-486-enriched exosomes inhibit PAEC migration induced... 56

Figure 12. miR-409 is induced in PDGF-stimulated PASMC exosomes.... 60

Figure 13. PAECs receive miR-409 via the PASMC-derived exosome.... 64

Figure 14. PASMC exosomes regulate the EC phenotype via exosomal miR-409.... 69

Figure 15. PASMCs proliferation is regulated by co-cultured with PAECs transfected with miR-... 80

Figure 16. miR-409 reduces LRP8 mRNA levels in PAECs 83

Figure 17. Crosstalk between PASMCs and PAECs via exosomal miR-409 90

초록보기

혈관 평활근 세포(VSMC)와 내피세포(EC) 사이의 세포 간 신호전달은 혈관 항상성 유지에 필수적 요소입니다. 최근 exosome이 혈관 세포 신호전달 역할을 하고 혈관 질환 진행과 관련이 있다고 밝혀졌습니다. 그러나 exosome에 의해 조절되는 신호가 혈관 질환에서 혈관 세포의 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 연구는 아직 부족합니다. 본 연구에서 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 등과 같은 자극에 의해 VSMC에서 분비되는 exosomal microRNAs(miRNAs)의 변화와 EC에 대한 발병기전의 관련성을 조사했습니다. 그 결과 PDGF 자극이 VSMC에서 분비되는 exosomal miRNA의 양을 조절한다는 것을 관찰했습니다. 구체적으로, miR-1246, miR-182 및 miR-486은 PDGF를 처리한 VSMC에서 유래한 exosome 내에서 감소되었고 반대로 miR-409는 증가됨을 확인하였습니다. Exosome에서 감소된 miRNA는 EC 이동 능력 증가와 관련이 있는 것을 밝혔습니다. Exosome에서 증가된 miR-409는 LRP8의 조절을 통해 내피 기능 장애를 유도하는 것을 밝혔고, miR-409가 증가된 EC와 공동 배양된 VSMC는 세포증식능력이 증가됨을 관찰하였습니다. 따라서 exosomal miR-409는 miR-409/LRP8/NO를 통해 VSMC와 EC의 세포 간 신호전달을 조절한다는 것을 알 수 있습니다. 이러한 발견들은 병리학적 조건에서의 혈관 세포 간의 exosome을 매개로 하는 세포 신호전달에 대한 이해를 높이는 데 기여할 것으로 기대됩니다.

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