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Title Page 1

Contents 6

Abstract 17

Graphic abstract 19

Abbreviations 20

Ⅰ. Introduction 23

A. Literature Review 23

1. Cancer cachexia and its related metabolism 23

2. Beta-carotene 32

3. Gut microbiota 36

4. Organoid 39

B. Hypothesis 42

Ⅱ. Study 1. Beta-carotene suppresses early cancer cachexia by regulating the adipose tissue metabolism and gut microbiota dysregulation 43

A. Introduction 43

B. Materials and Methods 45

1. Cancer cahceixa mouse model 45

2. Histological analysis 46

3. Serum IL-6, TNF-α and non-esterified fatty acid measurement 46

4. Gut microbiota analysis 46

5. Cell culture and reagents 48

6. CT26 and L-WRN conditioned medium collection 48

7. Differentiation of pre-adipocytes 49

8. Colon cancer organoid culture 50

9. Go-culture system of preadipocytes and colon cancer organoids 51

10. Immunofluorescent staining 51

11. Lipid accumulation measurements 52

12. RNA extraction and RT-qPCR 52

13. Metabolic characteristic measurements 53

14. Lactate, glucose uptake and ATP measurement 54

15. Statistical Analysis 56

C. Results 57

1. Effects of BC on the cachectic phenotypes in CT26 cancer-cachexia mouse model 57

2. Effects of BC on the lipolysis, fat browning, systemic inflammation and hepatic gluconeogenesis in CT26 cancer-cachexia mouse model 65

3.1. Isolation of patient-derived colon cancer organoids 73

3.2. Effects of BC on BODIPY staining in human preadipocytes co-cultured with colon cancer organoids 75

3.3. Effects of BC on mRNA expressions of adipogenesis-related markers in human preadipocytes co-cultured with colon cancer organoids 77

4. Effects of BC on adipogenesis in adipocytes existing in the cancer cachexia condition 79

5. Effects of BC on regulation of energy metabolism in adipocytes existing in the cancer cachexia condition 83

6. Effects of BC on regulation of energy metabolism in colon cancer cells 91

7. Effects of BC on gut microbiota diversity and structure in CT26 cancer-cachexia mouse model and the correlation between microbial profile and cancer cachectic observations 99

D. Discussion 111

Ⅲ. Study 2. BC suppresses late cancer cachexia by regulating the muscle atrophy and PI3K/Akt pathway 123

A. Introduction 123

B. Materials and Methods 126

1. Cancer cachexia mouse model 126

2. Assessment of grip strength 126

3. RNA extraction and RT-qPCR 127

4. Western blotting 127

5. ELISA assay 129

6. Hematoxylin & Eosin (H&E) Staining 129

7. Cell culture and reagents 129

8. LLC conditioned medium (CM) collection 129

9. Differentiation and LLC CM treantment of C2C12 myoblasts 129

10. Myotube length assessment 130

11. Cell viability assay 130

12. Statistical Analysis 130

C. Results 132

1. Effects of BC on the cachectic phenotypes in LLC cancer-cachexia mouse model 132

2. Effects of BC on muscle atrophy in gastrocnemius muscle in LLC-induced cancer cachexia mouse model 144

3. Effects of BC on myogenesis and muscle atrophy in myotubes existing in the cancer cachexia condition 152

D. Discussion 160

Ⅳ. General discussion 165

Ⅴ. General conclusion 167

Bibliography 168

Appendices 16

Appendix 1. Summary of analyzed 16S rRNA gene sequence information 187

Appendix 2. PCoA plot of the bacterial community using weighted UniFrac distance 188

Appendix 3. Spearman's rank correlation analysis showing relationships between measured values of selected features at the genus level 189

Appendix 4. Effects of BC on food intake in CT26 cancer-cachexia mouse model 190

Appendix 5. Effects of BC on food intake in LLC cancer-cachexia mouse model 191

국문초록 192

List of Tables 12

Table 1. Primer sequences for quantitative real-time PCR 55

Table 2. Effects of BC on the various types of fat and muscle weights in CT26 cancer cachexia mouse model 62

Table 3. Primer sequences for quantitative real-time PCR 128

Table 4. Effects of BC on weights of various types of fat and muscle dysregulation in LLC cancer cachexia mouse model 143

List of Figures 13

Figure 1. Effects of BC on body and organ weights in CT26 cancer-cachexia mouse model 58

Figure 2. Effects of BC on tumor volume in CT26 cancer-cachexia mouse model 60

Figure 3. Effects of BC on the size of subcutaneous fat cells in CT26 cancer-cachexia mouse model 64

Figure 4. Effects of BC on lipolysis in subcutaneous fats of cancer-cachexia mouse model 66

Figure 5. Effects of BC on fat browning in subcutaneous fats of cancer-cachexia mouse model 68

Figure 6. Effects of BC on hepatic gluconeogenesis of cancer-cachexia mouse model 70

Figure 7. Effects of BC on systemic inflammation in cancer-cachexia mouse model 72

Figure 8. Isolation of patient-derived colon cancer organoids 74

Figure 9. Effects of BC on BODIPY staining in human preadipocytes co-culture with colon cancer organoids 76

Figure 10. Effects of BC on mRNA expressions of adipogenesis-related markers in human preadipocytes co-culture with colon cancer organoids 78

Figure 11. Effects of BC on Oil Red 0 staining assay in 3T3-L1 cells treated with CT26 CM 80

Figure 12. Effects of BC on mRNA expressions of adipogenesis-related markers in 3T3-L1 cells treated with CT26 CM 82

Figure 13. Effects of BC on mitochondrial basal respiration in 3T3-L1 cells treated with CT26 CM 84

Figure 14. Effects of BC on glycolysis in 3T3-L1 cells treated with CT26 CM 86

Figure 15. Effects of BC on OCR/ECAR ratio in in 3T3-L1 cells treated with CT26 CM 88

Figure 16. Effects of BC on ATP production, lactate excretion, and glucose uptake in 3T3-L1 cells treated with CT26 CM 90

Figure 17. Effects of BC on mitochondrial basal respiration in HCT116 colon cancer cells 92

Figure 18. Effects of BC on glycolysis in HCT116 colon cancer cells 94

Figure 19. Effects of BC on OCR/ECAR ratio in HCT116 colon cancer cells 96

Figure 20. Effects of BC on ATP production, lactate, excretion, and glucose uptake in HCT116 colon cancer cells 98

Figure 21. Effects of BC on gut microbiota alpha diversity in CT26 cancer-cachexia mouse model 100

Figure 22. Effects of BC on gut microbiota beta diversity in CT26 cancer-cachexia mouse model 102

Figure 23. Effects of BC on the relative abundances of specific gut microbiota in CT26 cancer-cachexia mouse model 105

Figure 24. Effects of BC on the correlation between the diversity/structure of fecal microbiota and cancer cachectic observations in CT26 cancer-cachexia mouse model 107

Figure 25. Effects of BC on the analysis of the KEGG pathways in CT26 cancer-cachexia mouse model 110

Figure 26. Effects of BC on the tumor volume in LLC cancer-cachexia mouse model 133

Figure 27. Effects of BC on the body, organ weights, and food intake in LLC cancer-cachexia mouse model 135

Figure 28. Effects of BC on grip strenght in LLC cancer-cachexia mouse model 137

Figure 29. Effects of BC on the systemic inflammation in LLC cancer-cachexia mouse model 139

Figure 30. Effects of BC on hepatic gluconeogenesis in LLC cancer-cachexia mouse model 141

Figure 31. Effects of BC on myofiber size distribution in gastrocnemius muscle of LLC-induced cancer cachexia mouse model 145

Figure 32. Effects of BC on mRNA levels of the muscle atrophy-related marker in gastrocnemius muscle of LLC-induced cancer cachexia mouse model 147

Figure 33. Effects of BC on mRNA levels of the muscle stem cell-related marker in gastrocnemius muscle of LLC-induced cancer cachexia mouse model 149

Figure 34. Effects of BC on protein expressions of the PI3K/Akt pathway in gastrocnemius muscle of LLC-induced cancer cachexia mouse model 151

Figure 35. Effects of BC on the length and transverse diameter of myotube in C2C12 myoblasts treated with LLC CM 153

Figure 36. Effects of BC on the cell viability in C2C12 myoblasts treated with LLC CM 155

Figure 37. Effects of BC on myogenesis and muscle atrophy-related markers in C2C12 myoblasts treated with LLC CM 157

Figure 38. Effects of BC on the levels of pro-inflammatory cytokines in C2C12 myoblasts treated with LLC CM 159

초록보기

 암성 악액질은 여러 개의 인체 장기에 영향을 미치는 대사적 증후군으로, 가장 대표적인 특징으로 지방과 근육 손실이 나타난다. 암성 악액질은 암 환자의 항암 치료 반응, 치료 예후, 삶의 질 등에 부정적인 영향을 미치며, 암 환자 사망 원인의 20%를 차지할 만큼 심각한 문제이다. 지방 조직의 비정상적인 조절과 근육 손실은 암성 악액질 조절의 가장 중요한 두가지 요인이다. 지방과 근육 조직의 손실은 암환자의 기능적 손상과 삶의 질 악화를 유발할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 연구는 지방과 근육 조직의 다양한 대사와 관련된 메커니즘에 초점을 맞추었다. 뿐만 아니라,암성 악액질은 여러 개의 인체 장기가 서로 관여하는 다중 장기 질병이기 때문에, 본 연구는 장내미생물군, 간 포도당신생합성, 체내 염증도 분석하였다. 베타카로틴 (β-carotene)은 체내 지방 기능을 조절한다고 밝혀져 있으며, 체내 지방조직에 주로 저장된다. 또한, 선행 연구를 통해, 베타카로틴이 건강한 마우스의 근육량을 증가시켜 근육 비대를 유도함이 밝혀져 있다. 그러나, 베타카로틴의 암성 악액질에서의 지방과 근육 조직의 조절능력은 현재까지 연구된 바가 없다. 따라서, 본 연구는 다양한 in vitro와 in vivo 암성 악액질 모델 시스템들을 활용하여, 베타카로틴의 투여가 지방과 근육 조직의 비이상적인 대사, 장내 미생물군 조성, 간 포도당신생합성, 체내 염증을 조절하여 암성 악액질을 조절할 수 있는지를 규명하고자 하였다. 베타카로틴의 암성 악액질에서 지방대사에 미치는 영향을 분석하기 위해, 6주령의 수컷 BALB/c 마우스에 3x10⁶개의 CT26 대장암 세포를 피하 주사하여 암성 악액질을 유도한 후, 0.5와 2 ㎎/㎏ 농도의 베타카로틴을 35일 동안 구강 투여했다. 베타카로틴의 암성 악액질에서 근육대사에 미치는 영향을 분석하기 위해, 5주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에 lx10⁶개의 LLC 폐암 세포를 피하 주사하여 암성 악액질을 유도한 후, 4와 8 ㎎/㎏ 농도의 베타카로틴을 26일동안 구강 투여했다. CT26 유도 암성 악액질 마우스 모델에서는, 베타카로틴 투여에 따른 피하지방의 지방구 크기, 지방 분해 및 지방 갈색화 과정과 장내 미생물군 변화에 미치는 영향을 규명했다. CT26과 LLC 유도 암성 악액질 모델에서의 베타카로틴의 종양 부피, 몸무게 및 장기 무게, 체내 염증, 간 포도당신생합성, 지방과 근육 무게 조절 능력을 측정하였다. LLC 유도 암성 악액질 마우스 모델에서는, 베타카로틴 투여에 따른 비복근의 근섬유 크기별 분포와 근육 수축에 미치는 영향을 규명하였다. 또한, CT26 대장암 세포의 배양액을 처리한 3T3-L1 지방세포와 대장암 오가노이드와 공배양을 한 지방세포, 두가지 모델을 활용하여 베타카로틴의 지방 분화, 지방 분해, 에너지 대사에 미치는 영향을 규명하였다. 뿐만 아니라, LLC 폐암 세포의 배양액을 처리한 C2c12 근관세포에서 베타카로틴 처리에 따른 근관세포의 길이, 사이토카인 분비량, 근육 분화, 근육 수축의 변화를 측정하였다. 그 결과, 베타카로틴 처리에 의해 CT26 유도 암성 악액질 마우스 모델에서의 종양 형성, 지방량 손실, 피하 지방에서의 지방 분해와 갈색 지방화 과정, 간 포도당신생합성, 체내 염증이 억제된 효과가 나타났다. 또한, 암성 악액질에서 변화한 장내 미생물의 다양성과 구성이 베타케로틴 투여에 의해 회복되었다. 지방세포와 대장암 세포의 공배양 시스템을 활용하여, CT26 배양액 처리로 인해 변화된 지방세포의 지방분화 능력과 미토콘드리아 호흡과 해당과정이 베타카로틴 처리에 의해 회복되었다. 뿐만 아니라, 베타카로틴 처리가 LLC 배양액 처리로 인해 감소한 C2C12 근관세포 길이와 근육 분화와 증가된 근육 수축의 정상화에 도움을 주었다. 또한, LLC 유도 암성 악액질 마우스 모델에서는, 베타케로틴 처리에 의해 종양 형성, 염증성 사이토카인 분비량, 근육량 손실, 악력 감소가 유의적으로 저해되었다. 베타카로틴이 암성 악액질 마우스 비복근에서 Akt/mTOR 기전 조절을 통해 근섬유 크기 감소 및 근육 수축을 억제함을 밝혔다. 따라서, 본 연구는 베타카로틴이 지방과 근육 조직의 비이상적인 대사와, 장내 미생물군, 간포도당신생합성, 염증 조절을 통해 암성 악액질을 억제하는 효능을 지님을 처음으로 규명하였으며, 베타카로틴의 암성 악액질의 새로운 치료법 개발에 유용한 과학적 근거자료로 쓰일 수 있을 것이다.