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Title Page

Abstract

Contents

I. Introduction 9

II. Materials and Methods 11

1. Cloning and protein purification 11

2. Crystallization & Data collection 12

3. Ligand Extraction 12

4. Ligand analysis with HPLC 13

5. Isothermal titration calorimetry 13

6. In vitro enzymatic assay 13

III. Results & Discussion 15

1. Expression of protein 15

2. Sinefungin bound V. fischeri CmoA 15

3. Ligand extraction 16

4. Ligand analysis with HPLC 17

5. Isothermal titration calorimetry 18

6. In vitro enzymatic assay 19

IV. Conclusion 20

V. References 39

VI. Abstract in Korean 41

List of Tables

Table 1. List of primers 22

Table 2. Crystallographic statistic 23

Table 3. Thermodynamics of the interaction of E. coli and V. fischeri CmoA with Cx-SAM determined from ITC.. 24

List of Figures

Figure 1. Biosynthetic pathway of cmo5U modification 25

Figure 2. CmoA reaction mechanism 26

Figure 3. Chorismate pathway 27

Figure 4. SAM and metabolite used for co-crystallization 28

Figure 5. Overexpression of CmoA. 29

Figure 6. Size exclusion chromatography result of recombinant vibrio fischeri CmoA. 30

Figure 7. Multiple sequence alignment of CmoA homologs 31

Figure 8. V. fischeri CmoA structure. 32

Figure 9. overlay V. fischeri CmoA and E. coli CmoA. 33

Figure 10. Ligand interaction at Catalytic site of CmoA. 34

Figure 11. UV absorbance at 260nm of extracted ligand from E. coli CmoA and vibrio fischeri CmoA. 35

Figure 12. HPLC analysis of extracted ligand from E. coli CmoA. 36

Figure 13. Raw heat graph of E. coli CmoA & V. fishceri CmoA with Cx-SAM through Isothermal titration calorimetry. 37

Figure 14. HPLC analysis of in vitro enzymatic assay of E. coli CmoA & V. fischeri CmoA, 38

초록보기

tRNA 의 34 번째 유리딘은 생명체 내에서 거의 항상 변형되어 있다. 유리딘은 그람음성균에서 5-carboxymethoxyuridine(cmo5U)로 변형이 되는데, 카복시메틸 전이효소인 CmoA 와 CmoB 가 cmo5U 형성에 참여한다. CmoB 는 Cx-SAM 을 카복시메틸 공여자로 사용하여 cmo5U 를 형성한다. Cx-SAM은 CmoA 효소반응의 생성물로서, CmoA 가 prephenate 를 카복시메틸 공여자로 사용하여 생성하는 대사산물이다.

본 연구에서는 기질과 결합한 V. fischeri 종 CmoA 의 구조를 제안한다. 제시한 구조는 2 가지 기질 중 하나의 analog 만이 결합되어 있고 일부가 누락되어 있었다. 누락된 부분은 E. coli CmoA 에서 SAM 이 아닌 Cx-SAM 에 특이적으로 결합하는 Arg199 를 포함하고 있다. 이 구조는 Arg199 가 ligand binding site 에서 상호작용하는 분자의 존재유무에 따라 ligand 와 CmoA 의 결합 친화력에 영향을 줄 수 있다는 추측을 하게 해주었다. E. coli CmoA 와 V. fischeri 와 Cx-SAM 의 결합친화력 분석도 진행하였다. 마지막으로 여러 조건에서 정제한 CmoA 의 ligand 를 추출하고 분석을 진행하였다. Histidine tag 의 위치에 따라 CmoA 효소 활성이 달라졌고, 세포 내에서 CmoA 효소 반응에 사용되는 한 가지 기질의 생성을 차단하였더니 효소 반응이 진행되지 않은 것에 더해 효소와 기질의 결합친화력의 변화또한 나타났다. Histidine tag 위치에 따른 효소활성차이는 정확한 원인은 특정하지 못했지만, 효소활성에 영향을 주는 변수를 하나 더 찾아내어 연구의 방향을 늘려줄 것이다. 기질의 유무에 따른 효소반응의 확인 및 메커니즘의 증명은 지금까지 생체외에서만 이루어졌었지만, 이 실험결과를 통해 생체내 환경의 변화로도 효소활성의 차이를 끌어낼 수 있음을 알게되었다. 또한 효소활성의 유무를 넘어 결합친화력의 변화로 추측되는 결과는 효소와 ligand 의 분자적 상호작용에 대한 구조적인 통찰과 정보를 제공할 수 있다.

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