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Contents

요약 11

Chapter Ⅰ. Anti-Obesity Potential through Regulation of Carbohydrate Uptake and Gene Expression in Intestinal Epithelial Cells by the Probiotic Lactiplantibacillus plantarum MGEL20154 from Fermented Food 13

1. Introduction 14

2. Materials & Methods 16

2.1. Bacterial Strains and Culture Conditions 16

2.2. Isolation and Identification of Lp. plantarum 18

2.3. Cell Culture and Viability 19

2.4. Cell Surface Hydrophobicity, Auto- and Coaggregation 20

2.5. Enumeration of Bacterial Cells Adhered to Caco-2 21

2.6. Tolerance during the Simulated GI Tract 22

2.7. α-Amylase and Lipase Inhibition Assay 23

2.8. Genome Sequencing and Genomic Analysis 25

2.9. Animals, Diets, and Experimental Design 26

2.10. Histological Analysis 28

2.11. Gene Expression Analysis 29

2.12. Statistical Analysis 31

3. Results 32

3.1. Isolation and Identification of Lp. plantarum 32

3.2. Adhesion Properties of the Isolates 35

3.3. Resistance of the Isolates to a Simulated GI Tract 38

3.4. Enzyme Inhibitory Activity of the Selected Isolates 41

3.5. Comparative Genome Analysis of MGEL20154 43

3.6. Anti-Obesity Effects of MGEL20154 in HFD-Induced Obese Mice 50

3.7. Regulation of Gene Expression in Caco-2 Cells by MGEL20154 54

4. Discussion 58

Reference 66

Chapter Ⅱ. Lp. plantarum MGEL20154 regulates gut microbiota and adipocyte accumulation in HFD-induced obese mice 76

1. Introduction 77

2. Materals & Methods 79

2.1. Preparation and administration of probiotics 79

2.2. A nimals and the experimental design 80

2.3. Glucose tolerance test(GTT) 82

2.4. Serum biochemistry analysis 83

2.5. Morphological analysis 84

2.6. Histological analysis 85

2.7. Quantitative real-time PCR 87

2.8. Microbiota analysis 89

2.9. Statistical analysis 90

3. Results 91

3.1. Lp. plantarum MGEL20154 reduced weight gain, fat tissue accumulation in HFD mice 91

3.2. Lp. plantarum MGEL20154 reduced blood gucose, HOMA-IR and biochemical profile in HFD mice. 95

3.3. Lp. plantarum MGEL20154 alleviate NAFLD and reduce the liver weight. 98

3.4. Lp. plantarum MGEL20154 ameliorated fat metabolism and glucose transport at the mRNA level and reduced the inflammatory state of metabolic tissues. 101

3.5. Administration of Lp. plantarum MGEL20154 regulated the gut microbiota in HFD-fed mice. 104

4. Discussion 109

Reference 115

List of Tables

Chapter Ⅰ 17

Table 1. Bacterial strains used and culture conditions. 17

Table 2. Gene specific primers used in this study. 30

Table 3. Acid and bile tolerance of lactic acid bacteria in the simulated gastrointestinal tract. 39

Table 4. General genomic features of the MGEL20154 and related members of the Lp. plantarum subsp. plantarum. 45

Chapter Ⅱ 88

Table 1. Primer sequences used in PCR assays 88

Table 2. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on the average initial and final body weights, weight gain, feed intakes and food efficiency ratio (FER) 92

List of Figures

Chapter Ⅰ 33

Fig. 1. Sequence identity matrix and neighbor-joining phylogenetic tree of isolates. (a) Sequence identity matrix (%) of 16S rRNA sequences... 33

Fig. 2. Bacterial cell surface hydrophobicity, autoaggregation, coaggregation, and adhesion to Caco-2 cells. Sections a, b, and b show... 36

Fig. 3. Enzyme inhibition effects. α-amylase (a) and lipase (b) inhibition rate. The data are represented... 42

Fig. 4. Circular plot of the MGEL20154 plasmid. 46

Fig. 5. SEM image, ANI, and circular plot of MGEL20154. a) SEM of strain MGEL20154 grown on MRS medium for 16 h at... 47

Fig. 6. Genome annotation results of MGEL20154 on the RAST webserver. 49

Fig. 7. Effects of MGEL20154 administration in C57BL/6J obese mice. a) scheme of experiment design, b) body weight evolution, c) weight... 52

Fig. 8. The effect of MGEL20154 treatment on the mRNA expression of zo-1, cldn-1, ocln, and nf-κb in LPS-induced Caco-2 cells. The data... 55

Fig. 9. Effect of MGEL20154 treatment on the mRNA expression of erk2, pparα, and glut2 in Caco-2 cells treated with MGEL20154,... 57

Fig. 10. Proposed mechanism of Lp. plantarum MGEL20154 on anti-obesity effects through regulating mRNA expression in epithelial cells. 65

Chapter Ⅱ 93

Fig. 1. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on (a) body weight, (b) epididymal white tissue, (c) adipocyte size. Data are expressed as... 93

Fig. 2. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on (a) Blood glucose, insulin levels, HOMA-IR and glucose tolerance test, (b)... 96

Fig. 3. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on (a) Liver photograph and Liver weight, (b) photographs of H&E-stained sections of livers... 100

Fig. 4. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on (a) Ppar α, Ppar γ, Glut 2, Glut 4, (b) TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10. Data are expressed as... 102

Fig. 5. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on (a) alpha-diversity using CHAO1, ACE, Shannon index (b) Venn diagram of OTUs (c)... 107

Fig. 6. Effect of Lp. plantarum MGEL20154 on (a) Bacterial community at the phyla level (b) Bacterial community at the genus... 108

초록보기

 비만은 고지혈증, 당뇨, 심혈관계 및 염증성 질환 등 대사증후군과 밀접한 관련이 있어 전 세계적으로 공중보건에 문제가 되고 있다. 중추신경계에 작용하는 약물 기반 비만 치료의 심각한 부작용으로 생균치료제(Live Biotherapeutic Products; LBP)를 기반으로 하는 마이크로바이옴 치료제(Microbiome drug)가 대안으로 제시되고 있으며, 비만 완화 및 치료에 긍정적인 효과를 낸다는 임상연구가 지속적으로 보고되고 있다. 하지만 환자의 유전적, 환경적 특성에 따라 맞춤형 프로바이오틱스(Personalized probiotics)가 처방되어야 함에도 불구하고 현재까지는 strain 간 다중 분석 연구 및 LBP 원말의 핵심원천기술 부재 등의 이유로 한정된 프로바이오틱스만이 처방되고 있다.

따라서, 본 연구에서는 개인 맞춤형 질환 완화 프로바이오틱스 및 마이크로바이옴 치료제 개발의 일환으로 다양한 프로바이오틱스의 strain-specific 생리기능성을 확인하고자 하였으며, 그중 가장 우수한 장내 부착력과 생존력을 보인 Lp. plantarum MGEL20154의 프로바이오틱 특성과 항비만 효과에 대해 보고한다.

WHO/FAO에서 권고한 프로바이오틱스 기능성평가 가이드라인에 따른 in vitro test 결과, MGEL20154가 다른 균주에 비해 뛰어난 위장관 모사환경에서의 생존율(59.4%), 장부착능(46.4%) 및 소화효소 억제능(α-amylase; 66.8% & lipase; 68.1%)을 보임으로서 잠재적 프로바이오틱 후보임을 입증했다. 더불어, 전장유전체 분석을 통해 밝혀진 다량의 신규 glycosyltransferase는 host가 이용할 탄수화물을 대사하여 에너지 전환 효율을 감소시킴으로서 극대화된 항비만 능력을 발휘할 가능성을 시사하였다. 고지방식이(HFD) 유도 비만 마우스 모델(C57BL/6)을 이용한 동물실험에서 MGEL20154의 8주간 구강투여는 weight gain 43.81%, FER 46.67%를 감소시켰으며, 체지방량, 염증 및 인슐린 저항성을 유의적으로 감소시켜 포도당 대사와 지질대사의 개선을 유도하였다. 마이크로바이옴 분석 결과 MGEL20154 급이군에서 장내미생물 중 Lachnospiraceae와 Romboutsia의 비율을 HFD 그룹에 비해 각 25.12%, 6.65%로 상향조절 시킴으로서 마이크로바이옴 변화를 유도하여 염증 완화와 당 및 지질 대사 개선결과를 뒷받침하였다. 더욱이, MGEL20154는 당뇨병 치료제인 metformin과 프로바이오틱스 대조군으로 사용된 Lc. rhamnosus GG와 비교하였을때도 비만, 고지혈증, 비알코올성 지방간 질환 및 인슐린 저항성을 보다 효과적으로 개선하는 것으로 나타났다.

따라서, Lp. plantarum MGEL20154는 비만 및 대사성 질환 완화에 처방될 수 있는 프로바이오틱스로 잠재적 가능성을 보여주었으며, 향후 비만 및 대사질환 적응증 마이크로바이옴 치료제로의 유력한 후보임을 시사한다.

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