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Title Page

Contents

ABSTRACT 9

Chapter 1. Introduction 12

1.1. Conventional protein-protein interaction (PPI) study methods 12

1.2. Proximity labeling (PL) 16

1.3. Biotin ligase and peroxidase-mediated PL 18

1.4. TurboID-mediated PL in vivo 21

1.5. Research Aim 22

Chapter 2. Proximity labeling based profiling of piRNA biogenesis factor interactomes in Drosophila ovary 24

2.1. Piwi-interacting RNA (piRNA) role in transposon silencing 24

2.2. piRNA biogenesis by Zucchini (Zuc)-mediated processing and slicer-dependent pathways (ping-pong cycle) 26

2.3. Materials and Methods 29

2.3.1. Plasmid construct and cloning 29

2.3.2. Transgenic fly and Drosophila stock 29

2.3.3. Proximity labeling in fly tissue 30

2.3.4. Western Blot 30

2.3.5. Immunostaining 32

2.3.6. Mass spectrometry sample preparation 33

2.3.7. Liquid-chromatography mass-spectrometry (LC-MS) analysis 34

2.3.8. Bioinformatic & statistical analysis 35

2.3.9. Validation assay of Zuc interacting candidates 35

2.4. Result 37

2.4.1. Zuc-V5-TurboID induces biotinylation of proximal proteins in germline cells and biotin supplementation enhances biotinylation intensity 37

2.4.2. Identified biotinylated proximal proteins include several well-known piRNA-related proteins, involve in diverse biological processes and localize at various cell compartments 39

2.4.3. Zuc partner candidates may be involved in piRNA biogenesis and indirectly affect transposon silencing activity and genome instability 42

2.4.4. TurboID-V5-Aub induces biotinylation of proximal proteins in germline cells and biotin supplementation enhances biotinylation intensity 46

Chapter 3. Inter-organelle mitochondria-lipid droplet communication study by TurboID-based proximity labeling in Drosophila neuronal and glial cells 50

3.1. Mitochondria and lipid droplet communication 50

3.2. Marf and Lsd-2 description and function 52

3.3. Materials and Methods 54

3.3.1. Plasmid construct and cloning 54

3.3.2. Transgenic fly and Drosophila stock 55

3.3.3. Proximity labeling in fly tissue 55

3.3.4. Western blot 56

3.3.5. Biotinylated proteins enrichment with streptavidin beads 57

3.3.6. Mass spectrometry sample preparation 58

3.3.7. LC-MS analysis 59

3.3.8. Bioinformatic and statistical analysis 59

3.4. Result 60

3.4.1. NES-V5-TurboID induces biotinylation in a cell-type specific manner across various life stages of Drosophila and biotin supplementation enhances biotinylation intensity 60

3.4.2. Proximal proteins of Marf-V5-TurboID and Lsd-V5-TurboID were biotinylated in Drosophila neuronal and glial cells upon biotin addition, and also successfully enriched by streptavidin beads 63

3.4.3. Several biotinylated proximal proteins of V5-TurboID-NES in glial cells were already known to be distinctly localized in glial cells and also some proteins were overlapped in the cytoplasmic proteome of germline cells 68

Chapter 4. Discussion 70

REFERENCES 78

DECLARATION 83

ABBREVIATIONS 84

국문요약 90

List of Supplementary Tables

Supplementary Table 1. Primers designed for homologous recombination cloning 74

Supplementary Table 2. Primers designed for qPCR 77

List of Figures

Figure 1. Working flow of AP-MS analysis. 13

Figure 2. Principle of Y2H screening. 15

Figure 3. Principle of promiscuous enzyme-catalyzed proximity labeling. 17

Figure 4. Schematic workflow of biotinylation-based PL. (A) biotin ligase mode of action and (B) peroxidase-based labeling mechanism. 20

Figure 5. Transposon silencing mechanism by piRNA-induced silencing complex (piRISC). 25

Figure 6. piRNA biogenesis pathways in somatic and germ cells. 28

Figure 7. Experimental design for Zuc interacting candidates' validation assay (created with Biorender). 36

Figure 8. Proximity labeling in germline cells of Drosophila ovary by Zuc-V5-TurboID protein fusion. (A-D) Progeny of matα-Gal4 and w1118 crossed flies served as control.... 38

Figure 9. Proteomic analysis of labeled proximal proteins by TurboID protein fusions. (A) Experimental flow of mass spectrometry sample preparation (created with Biorender).... 41

Figure 10. Effect of Zuc partner candidate's knockdown in germline cells. (A-B) Transposons expression level upon knockdown of piRNA biogenesis-associated genes.... 45

Figure 11. Proximity labeling in germline cells of Drosophila ovary by TurboID-V5-Aub protein fusion. (A-D) Transgene expression in germline cells was driven by matα-Gal4.... 48

Figure 12. Experimental plan for TurboID-V5-Aub localization test (created with Biorender). 49

Figure 13. Illustration of tethering proteins that mediate inter-organelle communication between mitochondria and other organelles. 53

Figure 14. Proximity labeling by NES-V5-TurboID protein fusion in Drosophila tissue- specific cell types. (A) Schematic plan of proximity labeling attempt in muscle and brain-... 61

Figure 15. Schematic plan of proximity labeling attempt in mitochondria and LD of adult Drosophila neuronal and glial cells (created with Biorender). 64

Figure 16. Proximity labeling by Marf-V5-TurboID and Lsd-V5-TurboID fusion in neuronal and glial cells of adult Drosophila brain tissue. (A-B, E) Fusion protein... 67

Figure 17. Proteomic analysis of biotinylated proximal proteins by NES in glial and germline cells of Drosophila. (A-B) Courtesy of Dr. Choijamts Munkhzul. (A) Bar graph... 69

초록보기

 근접 표지법(Proximity labeling)은 최근에 개발된 강력한 단백질체 맵핑 기술로 생체 내에서 단백질의 구획화 및 단백질 상호작용 네트워크를 연구하는 데 사용되는 방법이다. 이는 생체 내에 희박하게 존재하거나 일시적으로 발현되는 또는 막과 결합한 단백질들에 대한 연구에 유용하다. 근접 표지법은 관심 있는 단백질과 융합된 혼합 효소를 사용하여 이웃하는 단백질을 공유결합으로 "표지(label)"하는 반응성 분자를 생성한다. 본 연구는 첫 번째 프로젝트에서 Drosophila 난소의 생식선 세포와 체세포성 난포 세포에서 Piwi-interacting RNA, piRNA 생합성 경로의 핵심 요소인 Zucchini(Zuc)의 상호 작용체를 조사하는 데 목적을 두고, 이를 위해 TurboID 기반 근거리 분자 표지 방법을 사용하였다. piRNA 는 마이크로 RNA(microRNA) 및 siRNA(short-interfering RNA)와 함께 작은 RNA 분자 중 하나로 전위요소(transposable element, TE) 또는 transposon 을 침묵시킴으로써 유전체 내의 무결성을 유지하는 역할을 한다. 다른 두 종류의 작은 RNA 와 달리, piRNA 의 생성은 특정 세포 내 구획에서 piRNA 생합성인자들의 국소화에 크게 의존적이기 때문에 고해상도 공간 단백질체학 접근법은 국소 상호작용을 식별할 수 있어 piRNA 생합성의 알려지지 않은 측면을 밝혀낼 수 있다. 본 연구는 정량적 질량 분석을 통해 생식 세포에서 275 개의 Zuc 근위 단백질체를 확인하였다. GO(Gene Ontology) 분석을 통해 chaperon-mediate, endo- 및 vesicle-과 같은 다양한 생물학적 과정에 관여하는 단백질들이 Zuc 의 새로운 상호작용 파트너가 될 수 있음을 밝혀내었으며, 유전자 knockdown 후 전위 요소의 비억제 수준을 확인하여 여러 개의 Zuc 파트너 후보들의 기능적 중요성을 검증하였다. 한편, piRNA 생합성 경로의 ping-pong pathway 는 생식 세포에 특화되어 있으며, 세포질에 존재하는 piRNA 단백질 Aubergine, Aub 및 Argonaute-3 에 의해 매개된다. 생식선 세포에서 Aub 근위 단백질들의 바이오틴화를 성공적으로 유도했으므로, 앞으로 ping-pong piRNA 생합성 경로에 대한 더 깊은 통찰력을 얻고자 Aub 근위 단백질체를 분석할 예정이다. 본 연구는 두 번째 프로젝트에서 미토콘드리아와 지질 방울(Lipid droplet, LD)사이의 세포소기관 상호작용을 연구하는 데 목적이 있고, 이를 위해 TurboID 기반 근접 표지법을 사용하였다. 미토콘드리아는 지방산을 산화하여 ATP 를 생성하는 필수적인 에너지 공장이며, 지질 방울(LD)은 ATP 생산에 필요한 지방산의 저장고로 알려져 있다. 앞선 선행 연구들에서 미토콘드리아 특이적 단백질인 Mitofusin 2, Mfn 2 와 지질 방울에 위치한 Perilipin, PLIN 단백질 패밀리 간의 상호작용이 보고되었으며, 예를 들어 중성지방(Triacylgylceride, TAG) 합성을 지원하는 것이 대표적이다. 이에 따라 Drosophila 모델에서 perilipin 패밀리 유사 단백질인 lipid storage-2 (Lsd-2)와 함께 Mfn 1 및 2 의 homolog 미토콘드리아 조립 조절 인자(mitochondrial assembly regulating factor, Marf)를 미토콘드리아 및 지질 방울에서의 근접 표지법을 위한 표적으로 설정하였다. Drosophila 성체 뇌의 신경 세포와 신경교세포에서 Marf 와 Lsd-2 근위 단백질의 바이오틴 표지를 성공적으로 유도했으므로, 앞으로 Marf 와 Lsd-2 상호 작용체의 분석을 통해 미토콘드리아와 지질 방울 사이의 상호 작용을 중개하는 단백질을 찾아낼 예정이다.

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