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ABSTRACT

Contents

1. Introduction 9

1.1. Disease diagnosis 9

1.2. Conventional detection methods of nucleic acid and amino acid 10

1.3. Cell-free protein synthesis 10

1.4. Retroreflection 11

1.5. Aim of the study 12

2. Materials and methods 15

2.1. Plasmids construction 15

2.2. Expression and purification of proteins 15

2.2.1. Universal reporter proteins 15

2.2.2. GST-TAD(P27L) 15

2.2.3. SpyTag003-Z domain-AzF 16

2.3. MST assay 16

2.4. Construction of cell-free protein synthesis systems 17

2.5. Reaction mixture of cell-free translation synthesis 17

2.6. Reaction mixture of Target-assisted synthesis of reporters (TASR) 18

2.6.1. Construction of sensor DNA 18

2.6.2. Annealing of target DNA and sensor DNA 18

2.6.3. Target-assisted synthesis of reporters (TASR) 19

2.7. Reaction mixture of amino acids detection 19

2.8. Conjugation methods 20

2.8.1. Conjugation of SpyTag003-Z domain-AzF / SpyTag003-azide to silica surface of RJPs using branched linker 20

2.8.2. Conjugation of GST-TAD(P27L) to glass surface using BS3 20

2.8.3. Conjugation of azide-PMIN8A to the glass surface using DBCO-sulfo NHS ester 21

2.8.4. Conjugation of azide-PMIN8A to glass surface using branched linker 21

2.9. Procedure of retroreflective sensing of the reporter protein after cell-free protein synthesis 22

2.10. Stability test of SpyTag003-conjugated RJPs 22

3. Results and discussion 23

3.1. Design of universal reporter protein 23

3.1.1. MDM2-TAD(P27L) pair 23

3.1.2. MDM2-PMI(N8A) pair 24

3.1.3. SpyCatcher/SpyTag system (003 version) 24

3.1.4. Improved universal reporter protein 25

3.1.5. Universal reporter protein functional analysis 28

3.2. Partner peptides conjugation strategy on RJPs and sensing chip surfaces 30

3.3. Pair determination through retroreflective sensing 33

3.4. Universal reporter protein detection through retroreflection after cell-free expression 38

3.5. Optimizations for time in the signal measurement process 38

3.6. Universal reporter protein expression and retroreflective sensing through target DNA recognition 42

3.7. Sensing strategy for amino acids detection 44

3.8. Engineering of universal reporter proteins to increase expression level 46

4. Conclusions 48

5. References 49

6. Abstract in Korean 52

List of Figures

Figure 1. Scheme of detecting various targets through retroreflection combined with a cell-free translation system. 14

Figure 2. Construction of universal reporter protein 26

Figure 3. Two versions of universal reporter protein. 27

Figure 4. Interactions between each pair of universal reporter protein. 29

Figure 5. Conjugation methods for RJPs. 31

Figure 6. Conjugation methods for sensing chip. 32

Figure 7. Retroreflective sensing results according to the presence or absence of universal reporter protein. 35

Figure 8. Conjugation strategy of PMI(N8A) to sensing chip. 36

Figure 9. Retroreflective sensing results according to concentrations of purified universal reporter proteins. 37

Figure 10. Retroreflective sensing strategy through cell-free protein synthesis. 40

Figure 11. Standard curve and optimization of the signal measurement process. 41

Figure 12. Universal reporter protein expression and retroreflective sensing strategy through target recognition. 43

Figure 13. Detection strategy of Amino acids using cell free translational system with retroreflection. 45

Figure 14. Expression test of engineered reporter proteins. 47

초록보기

 무세포 단백질 합성 시스템은 살아있는 유기체 없이도 생물학적 기능을 연구할 수 있는 수단을 제공한다. 합성 생물학, 대사 공학, 단백질 공학 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 전사 및 번역에 의한 신호 증폭과 유전자 회로를 결합하여 무세포 발현 시스템에서 고감도 검출 방법이 개발되어 왔다. 그러나 기존 방법은 형광, 발광 또는 전기 화학적 신호에 의존하는 경우가 많으며, 이를 감지하려면 특수한 장비와 절차가 필요하다. 더 간단하고 편리한 검출 방법을 개발하기 위한 시도가 계속되었다. 재귀반사는 표면에 닿은 빛이 다시 광원으로 향하는 현상으로, 간단한 광학 장치를 사용하여 신호를 감지할 수 있습니다. 본 연구에서는 무세포 단백질 발현과 재귀반사 야누스 입자(RJP)를 이용한 간단한 신호 검출 방법을 결합하는 플랫폼 및 범용 리포터 단백질을 설계하였다. 리포터 단백질은 두 개의 기능적인 도매인으로 이뤄지며, 한 도매인은 RJP와, 다른 도매인은 센서 칩 표면과 상호 작용한다. 따라서 공통지표물질은 센서 칩 표면에서 RJP의 정렬을 유도한다. DNA와 아미노산 등 여러 종류의 표적 분석물이 존재할 때, 하나의 리포터 단백질이 발현되어 검출된다. 무세포 발현 시스템의 간단한 분자 재조합을 통해 다른 표적에도 적용 가능함을 보여주었다. 따라서 이 플랫폼 기술은 다양한 질병의 진단에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

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