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Title Page

Abstract

Contents

ABBREVIATION 13

Ⅰ. Introduction 14

1. Osteoarthritis 14

2. Cartilage and chondrocytes in OA 15

3. Treatment of OA 16

4. Natural product extracts and single compounds in OA 18

5. BRD4 inhibitors and OA 20

6. Aim of this study 21

Ⅱ. Materials and Methods 24

1. Primary articular mouse chondrocyte culture 24

2. Reagents and Treatments 24

3. Cell viability analysis 25

4. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) 26

5. Western blot analysis 27

6. Prostaglandin E2 (PGE₂), collagenase assay and luciferase reporter gene assay 28

7. Animal study in OA mice 29

8. Cartilage tissue histology and immunohistochemistry 30

9. Culture of cartilage explants and Alcian blue staining 30

10. High-performance liquid chromatography (HPLC) analysis 31

11. Protein structural homology modeling 31

12. RNA-sequencing (RNA-seq) analysis and Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 32

13. Statistical analysis 33

Ⅲ. Results 34

PART Ⅰ. Inhibitory effect of natural product extracts and single compounds on OA 34

1. Schisandra extract and Schisandrol A suppress OA progression 34

2. Safflower seed extract represses OA pathogenesis 56

PART Ⅱ. Roles of a BRD4 inhibitor, ABC in OA ABC modulates OA progression by controlling catabolic factors 72

1. ABC reduces the expression of IL-1β-induced catabolic factors in mouse articular chondrocytes 72

2. ABC modulates the decay of cartilage in the DMM mouse model 76

3. ABC modulates the IL-1β-induced NF-κB and MAPK signaling pathways in articular chondrocytes 80

Ⅳ. Discussion 82

Ⅴ. Conclusions 95

Ⅵ. References 96

국문 초록 117

List of Tables

Table 1. Concentration of treated substances used in LDH assay 26

Table 2. Primer sequences and PCR conditions 27

List of Figures

Figure 1. The screening process for finding treatment candidates against OA from natural product extracts. 23

Figure 2. Schisandra extract suppresses the expression of Mmp3 and Cox-2 and the production of PGE₂ and collagenase in mouse articular chondrocytes... 36

Figure 3. Schisandra extract represses IL-1β-induced ECM degradation in cartilage explant ex vivo. 38

Figure 4. Oral administration of Schisandra extract minimizes cartilage destruction in the OA mouse model. 40

Figure 5. Administering Schisandra extract orally reduces the protein expression level of Cox-2 in the cartilage of a DMM mouse model. 42

Figure 6. Effect of Schisandrol A on articular chondrocytes. 44

Figure 7. Schisandrol A suppresses Cox-2 andMmp3 expression, production of PGE₂, and collagenase activity in articular chondrocytes stimulated by IL-1β. 45

Figure 8. Oral gavage of Schisandrol A controls cartilage destruction in the OA mouse model. 48

Figure 9. Schisandrol A inhibits β-TrCP involved with IL-1β-induced NF-κB signaling in articular chondrocytes. 52

Figure 10. Schisandra extract controls IL-1β-induced NF-κB and MAPK signaling. 54

Figure 11. Schisandra extract regulates IL-1β-induced NF-κB and MAPK signaling-related genes more than Schisandrol A in RNA seq analysis. 55

Figure 12. Viability of chondrocytes treated with Safflower seed extract, and Mmp3 and Mmp13 expression increase in chondrocytes stimulated by IL-1β at... 58

Figure 13. Safflower seed extract suppresses Mmp3 and Mmp13 expression and collagenase activity in articular chondrocytes stimulated by IL-1β. 59

Figure 14. Administering orally Safflower seed extract decreases cartilage degradation in a mouse model of DMM-induced osteoarthritis (OA). 61

Figure 15. Oral administration of Safflower seed extract reduces the protein expression levels of Mmp3, Mmp13, and IL-1β in the cartilage of the DMM... 62

Figure 16. High-performance liquid chromatography (HPLC) analysis of Safflower seed extract, and viability of articular chondrocytes under serotonin,... 65

Figure 17. Effect of serotonin, N-feruloyl serotonin, and N-(p-coumaroyl) serotonin on RNA expression levels of Mmp3 and Mmp13 in IL-1β-stimulated chondrocytes. 67

Figure 18. Safflower seed extract modulates IL-1β-induced phosphorylation of p65 and degradation of IκB. 69

Figure 19. N-(p-coumaroyl) serotonin and N-feruloyl serotonin control IL-1β-induced phosphorylation of p65 and degradation of IκB. 70

Figure 20. Safflower seed extract, N-(p-coumaroyl) serotonin, and N-feruloyl serotonin reduce IL-1β-induced NF-κB activation. 71

Figure 21. Chemical structure of ABC and JQ1, and viability of chondrocytes. 73

Figure 22. ABC reduces the expression of Mmp3, Mmp13 and Cox-2 and PGE₂ production in mouse articular chondrocytes stimulated by IL-1β. 74

Figure 23. Knee injection of ABC blocks mouse articular cartilage destruction in OA. 77

Figure 24. Knee injection of ABC decreases the expression of Mmp3, Mmp13, and Cox-2 in mouse articular cartilage in OA. 79

Figure 25. ABC regulates IL-1β-induced NF-κB and MAPK signaling. 81

Figure 26. Graphic summary of effect of Schisandrol A and Schisandra extract in OA. 92

Figure 27. Graphic summary of Safflower seed extract's effect in OA. 93

Figure 28. Graphic summary of anti-osteoarthritic effect of ABC. 94

초록보기

 골관절염 치료제는 주로 NSAID 약물이 사용되었으나 위장 장애와 신장 기능 저하 등의 부작용과 지속력이 짧다는 단점이 있으며, 새로운 치료제가 개발이 이루어지고 있지만, 대부분 진통완화 및 수술에 치중되고 있다. 그러므로, 부작용이 적은 장점을 가지고 있으며, 연골파괴 억제 효과가 있는 천연물 기능성 원료가 주목받고 있다. 천연물 기능성 원료를 이용한 새로운 골관절염 치료제 후보를 찾기 위해서 골관절염 억제 가능성이 있는 오미자 추출물과 홍화씨 추출물을 선별하였으며, 또한 위 천연물들을 구성하고 있는 단일화합물들을 이용하여 골관절염 억제 효과를 확인하였다. 마우스 관절에서 얻은 연골세포에 IL-1β를 처리하여 시험관 내 골관절염 환경을 만들어 주면 MMPs와 COX-2와 같은 이화인자들의 발현이 증가한다. 오미자 추출물과 오미자 추출물의 주성분인 Schisandrol A를 IL-1β를 처리한 연골세포에 처리하였을 때, 이화인자들의 발현이 감소하였고, 홍화씨 추출물과 홍화씨 추출물의 주성분인 N-(p-coumaroyl) serotonin와 N-feruloyl serotonin를 처리하였을 때 이화인자의 발현이 감소함을 분자생물학적 기법으로 확인할 수 있었다. 골관절염 동물 모델인 DMM model에 오미자 추출물과 Schisandrol A, 그리고 홍화씨 추출물을 경구 투여하였을 때, 연골의 파괴가 억제되고 이화인자들의 발현이 감소되는 것을 조직학적 분석방법을 이용하여 확인하였다. 또한, 오미자 및 홍화씨 추출물과 그를 구성하는 단일화합물들이 NF-κB 및 MAPK 신호전달 경로를 억제하여 이화인자의 발현을 억제한다는 것을 밝혀내었다. 결론적으로, 오미자 추출물과 홍화씨 추출물은 골관절염 억제 활성을 가진 여러 단일 화합물들을 함유하고 있기 때문에, 골관절염 치료제를 개발하기 위한 천연물 기능성 원료로 사용할 수 있는 가능성이 있음을 시사한다.

골관절염의 발병과정에서 후성유전학적 기전이 관여한다고 알려져 있으며, histone acetylation reader 단백질로 불리는 BET 단백질은 전사를 조절한다고 알려져 있고, BET 단백질 중 하나인 BRD4를 억제하는 단일 구조 화합물을 이용한 골관절염 억제 기전이 밝혀져 있다. 하지만, 기존에 알려진 억제제 중 하나는 약리학적 독성 및 부작용의 문제가 있다고 밝혀졌다. 그러므로, 기존에 밝혀진 억제제와 다른 구조를 가진 기존의 효과가 밝혀지지 않은 새로운 BRD4 단백질 억제제인 ABC의 골관절염에 의한 연골 파괴 억제 효과를 확인하였다. ABC는 IL-1β를 처리한 연골세포에 처리하였을 때, 증가한 이화인자들을 NF-κB 및 MAPK 신호전달 경로를 억제함으로써 감소시켰고, DMM model의 관절강 내로 주입하였을 때, 연골의 파괴를 억제함과 동시에 연골에서 발현되는 이화인자의 발현이 억제됨을 조직학적 분석방법을 이용하여 확인하였다. 추후, 치료제로 개발되기 위해선 안전성 평가를 포함하는 추가적인 실험을 진행해야 하지만, 결론적으로 ABC는 관절염 치료제로 개발될 수 있는 단일화합물로서 잠재성과 가능성이 있음을 시사한다.

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