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ABSTRACT

Contents

Ⅰ. INTRODUCTION 14

A. Necroptosis 14

B. Roles of receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) 15

C. Necroptosis in human pathogenesis 16

D. T cell homeostasis in thymus 17

E. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) 18

F. The aim of this study 19

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 20

A. Mice 20

B. Adeno associated virus (AAV)-mediated RIPK3 overexpression 21

C. Cell culture 22

D. Flow cytometric analysis 22

E. Serum biochemistry 23

F. Liver triglyceride measurement 24

G. Histological analysis 24

H. Proximal ligation assay (PLA) 26

I. Western Blot 26

J. Immunoprecipitation 27

K. Tandem Affinity Purification and Mass Spectrometry (TAP-MS) analysis 28

L. In vitro kinase assay 28

M. RNA-seq analysis 29

N. RNA extraction, cDNA synthesis and quantitative RT-PCR 29

O. Statistical analysis 30

Ⅲ. RESULTS 32

Part Ⅰ. RIPK3 maintains the homeostatic proliferation of CD4⁺ CD8⁺ double-positive (DP) T cells to restrain early onset of thymic lymphoma 32

A. RIPK3 deficiency leads to hyperproliferation of DP T cells in the thymus. 32

B. Increased DP T cells are independent of RIPK3-MLKL necroptosis pathway. 39

C. RIPK3 deficiency accelerates tumor progression in a carcinogen-induced model. 42

D. RIPK3 deficiency potentiates thymic lymphoma progression in p53⁻/⁻ mice.[이미지참조] 46

E. RIPK3 deficiency enhances thymic lymphoma via TCR-dependent ERK hyperactivation. 51

F. LCK interacts with RIPK3 and phosphorylates its tyrosine residue. 53

G. RIPK3 negatively regulates ERK phosphorylation through potentiation of PP2A activity. 58

H. Pharmacological modulation of PP2A activity regulates DP thymocyte proliferation in a carcinogen-induced mouse model. 61

Part Ⅱ. RIPK3 protects aberrant hepatic fat accumulation via regulation of hepatic lipid metabolism. 67

A. RIPK3 deficiency leads to age-dependent aberrant hepatic fat accumulation 67

B. RIPK3 was not the causative factor for hepatic steatosis. 74

C. Liver-specific overexpression of RIPK3 attenuates HFD-induced hepatic steatosis. 81

D. RIPK3 gene signatures were correlated with lipid metabolism. 90

Ⅳ. DISCUSSION 93

Part Ⅰ. RIPK3 maintains the homeostatic proliferation of CD4⁺ CD8⁺ double-positive (DP) T cells to restrain early onset of thymic lymphoma 93

Part Ⅱ. RIPK3 protects aberrant hepatic fat accumulation via regulation of hepatic lipid metabolism. 96

Ⅴ. REFERENCE 98

국문요약 113

List of Tables

Table 1. Primer sequences for real-time PCR in mouse samples. 31

List of Figures

Figure 1. RIPK3 deficiency leads to higher rate of spontaneous tumor formation. 34

Figure 2. RIPK3 deficiency leads to hyperproliferation of CD4⁺ CD8⁺ double positive T cells. 35

Figure 3. Analysis of architecture and immune cells from spleen of RIPK3-deficient mice. 37

Figure 4. RIPK3 and MLKL expression levels in various immune cell types. 40

Figure 5. Canonical necroptosis does not impact the proliferation and death of DP thymocytes. 41

Figure 6. Ripk3 loss leads to rapid progression of thymic tumor in a carcinogen-induced tumorigenesis model. 44

Figure 7. Carcinogen-induced thymic tumorigenesis was accelerated in RIPK3-deficient mice. 45

Figure 8. Tumor progression and incidence rate according to RIPK3 expression in thymic lymphoma-bearing p53-deficient mice. 47

Figure 9. Loss of Ripk3 accelerates tumorigenesis in p53 deficient mice. 49

Figure 10. RIPK3 deficiency promotes thymic lymphoma via ERK hyperactivation. 52

Figure 11. RIPK3 phosphorylated and activated under TCR signal activation. 55

Figure 12. TCR-mediated activation of LCK interacts with and RIPK3 to promote RIPK3 phosphorylation. 56

Figure 13. RIPK3 modulates proper ERK activation via regulation of PP2A activity. 59

Figure 14. Pharmacological inhibition of PP2A activity promotes DP thymocyte hyperproliferation. 62

Figure 15. Treatment of PP2A activator alters ERK phosphorylation status in thymic tumorigenesis. 64

Figure 16. The proposed model for LCK-mediated RIPK3 activation controls double-positive thymocyte proliferation and restrains thymic lymphoma by... 66

Figure 17. RIPK3-deficient mice showed increased body weight gain. 69

Figure 18. RIPK3 deficiency exhibited a higher rate of fatty liver incidence than littermate controls. 70

Figure 19. RIPK3 deficiency promotes age-dependent steatosis. 71

Figure 20. RIPK3 deficiency exhibited an aberrant fat accumulation phenotype in seven-month-old mice. 73

Figure 21. RIPK3 protein levels slightly increased with aging. 76

Figure 22. AAV-mediated liver-specific overexpression of RIPK3 attenuates HFD-induced hepatic steatosis. 77

Figure 23. AAV-RIPK3 mice exhibited reduced frequencies of neutrophils and pro-inflammatory macrophages. 79

Figure 24. RIPK3 exerts a protective effect during NAFLD progression. 83

Figure 25. RIPK3 overexpression resulted in reduced frequencies of pro-inflammatory leukocytes. 85

Figure 26. Mice exhibited a steatosis phenotype during four weeks of HFD feeding. 86

Figure 27. RIPK3 did not significantly affect liver phenotype in a 12 week HFD model. 88

Figure 28. RIPK3 regulates hepatic lipid metabolism. 92

초록보기

 네크롭토시스는 분자 기전에 의해 조절되는 용해성 세포 사멸 형태로, 세포 막 파괴를 통한 염증성 사이토카인 방출에 의해 면역 반응을 유도하는 것이 잘 알려져 있다. RIPK3 는 이러한 네크롭토시스 경로에서 필수적인 역할을 하는 단백질로써, RIPK1 과 Necrosome 이라는 복합체를 형성하며, 하위 단백질로 잘 알려진 MLKL 을 활성화 시킨다. RIPK3 는 다양한 방법으로 암, 바이러스 감염 및 대사 장애와 같은 다양한 인간 병인에 관여하며, 이는 RIPK3 가 상황에 따른 역할이 있을 수 있음을 시사한다. 따라서 RIPK3 가 질병의 진행에 기여하는 기전을 이해하는 것이 다양한 병인에서 치료의 타겟으로써 중요하다고 볼 수 있다.

RIPK3 의 발현은 다양한 종류의 암에서 낮아져 있으며, 이는 RIPK3 가 암 억제제로서의 성질을 갖는다는 것을 유추할 수 있다. 그러나, 암 발생과 진행에 있어서 구체적인 기전 규명은 정확하지 않은 상황이기 때문에, 첫 번째 연구에서 나는 RIPK3 의 종양형성에서의 기능을 연구하고자 하였다. RIPK3 유전자의 결핍이 자연스럽게 발생하는 암 형성을 증가시키는 것을 확인하였으며, 이 때 암은 흉선에서 촉진되는 것을 다양한 마우스 모델을 통하여 확인하였다. 또한 RIPK3 유전자 결핍에 의해 어린 마우스에서 흉선에서의 CD4+CD8+T 세포의 비정상적인 증식을 관찰하였다. 이에 대한 기전 규명으로는, RIPK3 가 LCK 에 의해 활성화되고, 활성화 된 RIPK3 가 PP2A 라는 포스파타아제의 효소 활성을 증가시킴으로써 ERK 단백질의 과활성화를 억제하여 흉선 암 형성을 억제한다는 것을 확인하였다.

첫 번째 연구를 수행하면서, 나는 RIPK3 유전자 결핍에 의해 간에서의 비정상적인 표현형 또한 확인하였다. RIPK3 가 결핍된 마우스는 약 7 개월령부터 간에서 지방이 비정상적으로 축적되는 현상을 확인하였다. 하지만 RIPK3 가 지방간 형성을 촉진한다는 보고는 이전에도 있었고, 억제한다는 보고 또한 있기 때문에 두 번째 연구로 RIPK3 가 간 지방증에서 어떠한 역할을 하는지 규명하고자 하였다. 마우스에 간세포 특이적으로 RIPK3 를 과 발현 시킨 다음, 고지방식이를 급여하는 모델을 사용해 간에서 RIPK3 발현 증가에 따른 지방증의 감소를 추가적으로 관찰하였다. 또한 RIPK3 가 간에서 지질 대사를 조절하여 이러한 결과를 나타내었을 것이라는 사실을 확인하였다.

종합적으로, 이 연구를 통해 RIPK3 단백질이 흉선 림프종 형성과 간 지방증을 억제하는 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었고, 따라서 이러한 질병에서 RIPK3 를 확인하는 것이 중요하다고 생각되어진다.

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