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Contents

국문초록 7

ABSTRACT 9

Ⅰ. Chapter 1. Antifungal Mechanism of Vip3Aa, a Vegetative Insecticidal Protein, against Pathogenic Fungal Strains. 11

Ⅰ-1. Introduction 11

Ⅰ-2. Materials and Methods 14

Ⅰ-2-1. Materials 14

Ⅰ-2-2. Fungal Cells 14

Ⅰ-2-3. Cloning and Protein Expression of the Vip3Aa Gene in E. coli 14

Ⅰ-2-4. Purification and Structural Analysis of the Vip3Aa Protein 15

Ⅰ-2-5. Antifungal Assay 15

Ⅰ-2-6. Cytotoxicity Assay 16

Ⅰ-2-7. Membrane Integrity Assay Using PI 17

Ⅰ-2-8. Analysis Using CLSM 17

Ⅰ-2-9. MitoSOX Levels 18

Ⅰ-2-10. Apoptosis Measurement 18

Ⅰ-2-11. Analysis Using SEM 18

Ⅰ-3. Result 19

Ⅰ-3-1. Antifungal Activity of Vip3Aa Protein against Pathogenic Fungi 19

Ⅰ-3-2. Molecular Mechanism of the Vip3Aa Protein in Fungal Cells 25

Ⅰ-3-3. Intracellular Localization and Molecular Mechanism of Vip3Aa in Fungal Cells 27

Ⅰ-3-4. Intracellular ROS Production and Apoptosis Induction by Vip3Aa 31

Ⅰ-3-5. Morphological Alterations Caused by Vip3Aa in Fungal Cells 34

Ⅰ-4. Discussion 37

Ⅱ. Chapter 2. Potent Antifungal Functions of a Living Modified Organism Protein, CP4-EPSPS, Against Pathogenic Fungal Cells 38

Ⅱ-1. Introduction 38

Ⅱ-2. Materials and Methods 41

Ⅱ-2-1. Materials 41

Ⅱ-2-2. Fungal Strains 41

Ⅱ-2-3. Cloning of CP4-EPSPS Gene and Expression of the Protein in Escherichia coli 41

Ⅱ-2-4. Peptide Synthesis 42

Ⅱ-2-5. SEC and PAGE 43

Ⅱ-2-6. Antifungal Assay 44

Ⅱ-2-7. Analysis using Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) 44

Ⅱ-2-8. PI Uptake Assay 45

Ⅱ-2-9. SYTOX Green Uptake Assay 45

Ⅱ-2-10. Mitochondrial Superoxide Assay 45

Ⅱ-2-11. Scanning Electron Microscopy 46

Ⅱ-3. Results 47

Ⅱ-3-1. Expression and Purification of Agrobacterium EPSPS Protein 47

Ⅱ-3-2. Antifungal Activity of CP4-EPSPS 49

Ⅱ-3-3. Subcellular Localization of CP4-EPSPS in Fungal Cells 54

Ⅱ-3-4. Cellular Uptake of CP4-EPSPS Protein via Membrane Integrity Change 56

Ⅱ-4. Discussion 62

Ⅲ. References 63

List of Tables

Table 1. Antifungal activity of VIP3Aa against fungal cells. 23

Table 2. Antifungal activity of CP4-EPSPS protein against fungal strains. 50

List of Figures

Figure 1. Purification and characterization of recombinant Vip3Aa protein. (A) Recombinant Vip3Aa protein was purified The short vertical lines indicate standard markers that were calibrated with bovine thyroglobulin (669... 22

Figure 2. Hemolysis and cytotoxicity of Vip3Aa against rat erythrocytes (A) and HaCaT cells (B). (A) After 1 h incubation in the presence of proteins at the represented concentration, the absorbance of hemoglobin released... 24

Figure 3. Concentration and time-dependent antifungal effects of recombinant Vip3Aa in C. albicans cells. (A) Concentration dependent inhibition of fungal growth at 12 h incubation. (1): Control, (2): 31.3 μg/mL Vip3Aa,... 26

Figure 4. Cellular binding and uptake of Vip3Aa in C. albicans cells. Rhodamine-labeled melittin and Vip3Aa were incubated for the given time points at the IC₅₀ concentration, and the treated cells were analyzed using... 29

Figure 5. Cellular distributions of Vip3Aa in C. albicans cells. (A) After incubating C. albicans cells with rhodamine-labeled melittin (1) for 1 h and Vip3Aa (2) for 12 h, the fungal cells were washed and examined... 30

Figure 6. Generation of mitochondrial superoxide (MitoSOX) and induction of apoptosis by Vip3Aa. (A) After incubation of Vip3Aa, MitoSOX probe was added in the cells and analyzed by fluorescence microscopy and... 33

Figure 7. Time-dependent morphological changes in Vip3Aa-treated C. albicans cells. (A): control, (B): melittin (31.3 μg/mL, 4 h incubation), (C): Vip3Aa (62.5 μg/mL, 4 h), (D): Vip3Aa (62.5 μg/mL, 12 h), (E): Vip3Aa... 35

Figure 8. Characterization and purification of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) from Agrobacterium sp. strain CP4 (CP4-EPSPS) protein. The recombinant CP4-EPSPS protein expressed by E. coli... 48

Figure 9. Antifungal activity of the CP4-EPSPS protein against C. gloeosporioides (A) and C. krusei (B). Concentration-dependent growth inhibition of CP4-EPSPS in liquid cultivation was visualized under microscope.... 51

Figure 10. Dose-dependent effects of the CP4-EPSPS protein and melittin on conidia germination and survival of C. gloeosporioides conidia. (A) Germinated C. gloeosporioides conidia were quantified using microscopy after... 53

Figure 11. Localization of rhodamine-labeled CP4-EPSPS protein in C. gloeosporioides hyphal cells. Representative confocal images showing cells without protein (A) and with rhodamine-labeled CP4-EPSPS (B)... 55

Figure 12. Membrane permeability of CP4-EPSPS and melittin in C. gloeosporioides cells. (A, B) After treatment with phosphate-buffered saline (PBS) (a), CP4-EPSPS (b), or melittin (c) at MIC for 2 h, SYTOX... 59

Figure 13. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation in C. gloeosporioides cells. After 4 h incubation with PBS (A), CP4-EPSPS (B), or melittin (C), the MitoSOX probe was added to the cells (5 µM),... 60

Figure 14. Morphological changes in CP4-EPSPS-treated C. gloeosporioides cells. Samples were incubated for 6 h at MICs, and cells were fixed, dehydrated, coated, and observed using a scanning electron microscope (SEM):... 61

초록보기

 인간의 삶의 질 향상을 위하여 국내·외 다양한 연구를 통해 개발된 물질들은 의약품/의약외품, 식품, 화장품, 생활용품 등 다양한 산업에 활용되고 있다. 하지만, 개발된 물질들은 대부분 인위적으로 제조한 화학물질로써 내성 뿐 아니라 다양한 부작용을 가지고 있다는 단점을 가진다. 그에 따라, 최근 식물로부터 유래된 단백질의 활성 및 안전성 그리고 작용기전 연구가 활발히 이루어지고 있고, 유용한 생리활성 물질로 개발되어 고부가가치 산업의 제품으로 생산 및 이용되고 있다.

항균 펩타이드는 모든 종류의 생명체에서 발견되는 선천적인 면역 반응의 일부로, 1962년 개구리(Bombina variegate)의 표피 분비액에서 24개의 아미노산으로 구성된 봄비닌(bombinin)을 최초로 분리하였고, 그 후 1971년 벌의 독소(bee venom)으로부터 멜리틴(melittin) 이란 펩타이드가 정제되는 등 다양한 생물로부터 항균 펩타이드의 특성 및 활성에 관한 연구가 수행되고 있다.

따라서, 제 1장에서는 바실러스 튜링겐시스(bacillus thuringiensis)의 cDNA를 활용하여 살충 단백질(insecticidal protein)인 Vip3Aa를 재조합하였고, 이를 통하여 항진균 활성 및 작용기전을 평가하였다. Vip3Aa 단백질은 효모 및 사상균에 대해서 각각 62.5~125 μg/mL, 250~500 μg/mL에서 억제 농도(inhibitory concentrations; IC)로 다양한 농도와 시간 의존적인 항진균 활성이 확인되었다. 또한, 칸디다 알비칸스에서 프로피디움 요오드(propidium lodide; PI)의 흡수 및 로다민(rhodamine)이 표지된 Vip3Aa를 활용하여 Vip3Aa가 진균세포를 투과하여 세포내에서 손상을 유발시킴으로써 성장을 억제하는 것을 확인하였다. 그리고, 미토콘드리아 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)의 생성과 핵산과의 결합을 통하여 세포사멸이 유도됨으로써 세포사멸(apoptosis)이 유발됨을 확인하였다. 이러한 결과는 Vip3Aa 단백질이 천연 항균제 개발에 있어서 잠재적인 활용도가 있음을 시사한다.

제 2장에서는 유전자변형생물체(Living modified organism; LMO)의 단백질인 아그로박테리움(agrobacterium SP. CP4-EPSPs)의 CP4 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) 재조합 단백질에 대하여 항진균 효과를 분석하였다. 대장균에서 발현되는 순수한 CP4-EPSPS 단백질은 62.5-250 μg/mL의 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentrations; MICs) 에서 인간 및 식물 진균 병원체(Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, F. graminearum 및 Trichoderma virens)의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 그리고 C. gloeosporioides에서 세포증식 뿐 아니라 곰팡이 포자 발아를 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 로다민이 표지된 CP4-EPSPS활용하여 곰팡이 세포의 세포벽과 세포질에 축적되는 것이 확인되었지만, 세포 내 미토콘드리아 활성산소종의 발생은 관찰되지 않았다. 하지만, 진균세포의 형태 관찰을 통하여 세포 표면이 손상되는 것을 확인하였고, 이는 CP4-EPSPS가 진균 세포벽의 투과를 유도함에 따라 항진균 작용에 기인한다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 유전자변형생물체 단백질인 EPSPS가 곰팡이 성장에 미치는 영향에 대한 정보로써 활용될 수 있다.

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