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국문 초록

ABSTRACT

목차

Ⅰ. 서론 16

Ⅱ. 재료 및 방법 20

1. 사용균주 및 배양조건 20

2. 살균 활성 미생물 선발 21

3. 선발미생물의 계통학적 분석 22

4. 대치배양을 통한 KRA20-207의 살균 활성 검정 23

5. KRA20-207 배양여액으로부터 활성 물질의 분리 24

6. 분리된 유효활성물질의 화학 구조 동정 26

7. 키다리병원균에 대한 minimum inhibitory concentration(MIC) 및 effective half maximal concentration(EC₅₀) 조사 28

8. 병원균의 균사 생장에 미치는 영향 조사 29

9. 병원균의 포자 형성 및 포자 발아에 미치는 영향 조사 29

10. 세포 투과성 및 세포학적 살균 활성 조사 30

11. FB₁의 정량 분석 31

(1) 배양액으로부터 FB₁ 추출 31

(2) FB₁ HPLC 분석 조건 32

12. 선발 소재의 키다리병 방제 효과 검정법 33

13. 다양한 식물병원균에 대한 MIC 조사 34

14. 6가지 식물곰팡이병에 대한 방제 효과 검정법 35

15. 품종 별 벼 키다리병 발생차이 조사 37

16. 통계 분석 38

Ⅲ. 결과 및 고찰 39

1. 살균 활성을 가지는 KRA20-207의 선발 및 계통학적 분석 39

2. 대치배양에 따른 KRA20-207의 우수한 살균 활성 42

3. KRA20-207 배양여액의 살균 활성 42

4. KRA20-207 배양여액의 균사 생장 억제 효과 45

5. KRA20-207 배양여액의 포자 형성 및 포자 발아 억제 효과 47

6. 벼키다리병원균에 대한 살균 활성 물질의 구조 동정 49

7. ECO-02301의 벼키다리병원균에 대한 MIC 54

8. ECO-02301의 균사 생장 억제 효과 54

9. ECO-02301의 포자 형성과 포자 발아 억제 효과 57

10. ECO-02301의 세포 투과성에 미치는 영향 59

11. 선발 소재의 FB₁ 생성 억제 효과 61

12. KRA20-207의 in vivo 살균 활성 63

13. ECO-02301의 광범위 살균 활성 스펙트럼 65

14. 선발 소재의 식물곰팡이병 방제 효과 67

15. 품종에 따른 벼 키다리병의 발병도 70

Ⅳ. 결론 72

참고문헌 74

표목차

Table 1. Primers used in this study. 38

Table 2. Antimicrobial activity spectrum of plant ECO-02301. 66

Table 3. Disease control efficacy of Streptomyces wistariopsis KRA20-207. 68

그림목차

Figure 1. Isolation scheme of the antifungal compound from the culture broth of Streptomyces wistariopsis KRA20-207. 27

Figure 2. Phylogenetic analysis of Streptomyces wistariopsis KRA20-207. 40

Figure 3. Morphlogical feature of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 grown on Bennett's medium at 28℃ for 7 days. 41

Figure 4. Dual culture of Streptomyces wistariopsis KRA20-207. Dual culture assay of S. wistariopsis KRA20-207 against F. fujikuroi B14. 43

Figure 5. MIC value and EC₅₀ of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 culture filtrate against Fusarium fujikuroi B14.... 44

Figure 6. Effects of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 culture filtrate on Fusarium fujikuroi B14 mycelium growth. (A) Culture platesof F. funjikuroi grown for 6 days on PDA which contain S. wistariopsis KRA20-207 culture filtrate. (B) Relative... 46

Figure 7. Effects of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 culture filtrate on Fusarium fujikuroi B14 fungal development.... 48

Figure 8. ESI-MS spectrum of the antifungal compound isolated from Streptomyces wistariopsis KRA20-207 culture filtrate. Compound 1 molecular weight confirmed 1298. 50

Figure 9. Nuclear magnetic resonance spectra of the antifungal activity compound isolated from Streptomyces wistariopsis KRA20-207 culture filtrate.... 51

Figure 10. Nuclear magnetic resonance spectra of ECO-02301 from previous research(McAlpine et al., 2005). (A) ¹H spectrum and (B) ¹³C spectrum in CD₃OD-d₄. 52

Figure 11. Chemical structure of the antifungal compound ECO-02301 isolated from Streptomyces wistariopsis KRA20-207. 53

Figure 12. MIC value and EC₅₀ of antifungal compound ECO-02301 against Fusarium fujikuroi B14.... 55

Figure 13. Effects of antifungal compound ECO-02301 on Fusarium fujikuroi B14 mycelium growth. (A) Culture plates of F. funjikuroi grown for 6 days on PDA which contain S. wistariopsis KRA20-207 active compound... 56

Figure 14. Effects of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 active compound ECO-02301 on fungal development.... 58

Figure 15. Effects of antifungal compound ECO-02301 on Fusarium fujikuroi cell permeability. Middle pannel exhibited F. fujikuroi B14 hyphae stained by PI depending on concentration. Bottom pannel exhibited... 60

Figure 16. Effects of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 on FB₁ production. Quantitative analysis of FB¹ product by F. fujikuroi B14 treated with culture... 62

Figure 17. In vivo antifungal activity of Streptomyces wistariopsis KRA20-207 culture filtrate and ECO-02301. Fludioxonil was used as a positive control. Photos were taken at 2 dpi. 64

Figure 18. Representative plants showing disease control efficacy of Streptomyces wistariopsis KRA20-207.... 69

Figure 19. Relative growth inhibition by Fusarium fujikuroi B14 to 15 different Oryzae sativa cultivars.... 71

초록보기

 벼 키다리병을 일으키는 병원균인 Fusarium fujikuroi는 벼의 수확량을 감소시키는 식물병원성 곰팡이이다. 본 연구에서는 F. fujikuroi B14에 살균 활성을 갖는 토양 미생물 소재를 탐색하던 중, 살균 활성이 우수한 KRA20-207을 선발하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 기반으로 KRA20-207은 Streptomyces wistariopsis로 동정되었다. KRA20-207의 배양여액은 F. fujikuroi B14에 대하여 1.25%의 최소 억제 농도를 나타내었다. 또한, KRA20-207의 배양여액을 2.5%의 농도로 처리하였을 때 균사 생장을 84.3%, 포자 발아를 100% 억제하였다. KRA20-207 배양여액으로부터 유효생리 활성물질을 순수 분리하고자, 다양한 크로마토그래피 분석을 실시하였으며, 질량 분광 분석과 핵자기공명 분석을 통하여 순수 분리한 물질은 ECO-02301으로 동정하였다. 단일 물질 ECO-02301은 F. fujikuroi B14에 대하여 2.5 μg/mL의 최소 억제 농도를 나타내었다. ECO-02301을 2.5 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 균사 생장을 93.6%, 포자 발아는 95.6% 억제하였고, 1.5 μg/mL의 농도 이상부터는 24시간 뒤 세포 침투성과 세포 생존력에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 벼 엽면에 point-inoculation 방법으로 S. wistariopsis KRA20-207의 배양여액을 처리하였을 때, 3배 희석액에서 73%, 원액에서는 100%의 방제 활성을 나타내었고, 유효생리활성물질인 ECO-02301을 500 μg/mL의 처리하였을 때, 96%의 방제 활성을 보였다. ECO-02301은 벼키다리병원균 이외에도 다양한 식물병원성 곰팡이에 대하여 우수한 in vitro 및 in vivo 살균 활성을 나타내었다. ECO-02301을 500 μg/mL의 농도로 토마토에 처리 시, 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대하여 각각 84%와 81%의 방제 활성을 나타내었다. 따라서 S. wistariopsis KRA20-207의 배양여액과 ECO-02301은 벼 키다리병을 포함한 다양한 식물병 방제에 활용할 수 있다.

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