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Contents

ABSTRACT IN KOREAN 8

Ⅰ. INTRODUCTION 10

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 13

1. Bacterial strains and growth conditions 13

2. Screening of mutant library 13

3. Generation of the complemented strain and green fluorescence protein (GFP)-tagging strains 15

4. Bacterial growth in methionine-limited media 15

5. Pathogenicity tests 16

6. PCWDE assays 17

7. RNA sequencing and data analysis 18

8. Statistical analysis 19

Ⅲ. RESULTS 21

1. In vitro transposon screen selects the metC mutant inducing Pcc21 biofilm formation 21

2. Inactivating metC becomes a methionine auxotroph 23

3. Inactivating metC requires a higher concentration of exogenous methionine to overcome auxotrophy 26

4. Inactivating metC decreases soft rotting symptoms in Chinese cabbages and potato tubers, regardless of extracellualr enzymatic and motile activities 28

5. Inactivating metC requires a large amount of exogenous methionine for virulence 32

6. Differentially expressed genes (DEGs) between Pcc21 wild-type and ΔmetC at the early infection stage 35

Ⅳ. DISCUSSION 40

Ⅴ. CONCLUSION 44

REFERENCES 45

Abstract 52

List of Tables

Table 1. Summary of significantly differentially expressed genes (DEGs) related to methionine biosynthesis and transporter and... 39

List of Figures

Fig. 1. Verification of the metC mutant in Pcc21. 24

Fig. 2. Requirement of exogenous methionine to overcome methionine auxotrophy 27

Fig. 3. Virulence and growth of the metC mutant on Chinese cabbage and potato tuber. 30

Fig. 4. Plant cell-wall degrading enzymes (PCWDEs) activities and swimming motility of ΔmetC. 31

Fig. 5. Growth and viability of the metC mutant on Chinese cabbage for 36 hpi. 33

Fig. 6. Requirement of exogenous methionine to restore virulence of the metC mutant on potato tuber. 34

Fig. 7. Comparative transcriptomic analysis in Pcc21 wild-type and the metC mutant infecting to Chinese cabbage slices at 4 hpi. 38

초록보기

 Pectobacterium 종은 경제적으로 중요한 광범위한 작물에서 심각한 무름병과 검은병을 일으키는 전 세계적으로 분포된 식물 병원균이며, 식물 세포벽 분해 효소 (PCWDE)가 병원성의 주요 독성 결정인자로 알려져 있다. 우리는 5,184개의 트랜스포존 돌연변이체에 대한 스크리닝을 통해, P. carotovorum subsp Pcc21에서 생물막 형성이 2배 이상 증가하거나 운동성이 변한 20개의 돌연변이체를 확보했고, 이 중 cystathionine β-lyase를 코딩하는 metC 유전자의 돌연변이 균주를 통해 생장 및 병원성에서 MetC의 역할에 대해 연구를 진행했다. MetC는 methionine 생합성의 두 번째 단계에서 cystathionine을 homocysteine으로 촉매하는 효소이며, metC의 비활성화는 methionine이 제한된 배지에서 생장 결함을 유발하고 생물막의 형성을 증가시켰다. 돌연변이 균주는 외부적인 methionine 또는 homocysteine이 제한된 배지에서 생장하지 못했으나 MetC 유전자가 보완된 균주와 외인성 methionine을 포함하는 배지에서는 모두 성공적으로 복원되었다. 그리고 이러한 영양요구성을 극복하기 위해서는 고농도의 외인성 methionine (50~100μM)이 필요함을 확인했다. 돌연변이 균주는 배추와 감자에서 감소한 병원성과 생장을 나타냈지만, PCWDE 및 운동성에서는 변화가 없었기 때문에 이는 MetC에 의해 감소한 병원성이 알려진 병원성요인들과는 독립적임을 나타낸다. 그리고 감소한 병원성은 보완된 균주 또는 100 μM의 methionine에 의해 부분적으로 회복되었으며 매우 높은 농도 (1,000μM)에서 완전히 회복되었다. Whole transcriptomic analysis를 통해 methionine 생합성 및 수송에 관여하는 유전자가 돌연변이에서 하향 조절됨을 보여줬고. 이 결과는 cystathionine β-lyase가 methionine 생합성 및 획득을 통해 숙주에서 Pcc21의 병원성 및 성장에 중요하다는 것을 입증한다.

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