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Contents

Abstract 16

CHAPTER 1. Inhibitory effect of Jangkanghwan (Korean traditional health food) on experimental ulcerative colitis in mice 21

Ⅰ. INTRODUCTION 22

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 24

1. Source of Jangkanghwan 25

2. UPLC-Q-TOF MS conditions of Jangkanghwan 25

3. Animal experiments 26

4. Evaluation of disease activity index (DAI) 27

5. Hematoxylin and eosin (H&E) sections analysis of colon tissue 27

6. Measurements of serum IL-6, IL-1β, TNF-α, and IFN-γ cytokine levels in mice 30

7. mRNA expression determination using RT-qPCR 30

8. Protein expression determination by Western blotting 30

9. Next-generation sequencing (NGS) analysis of murine feces 32

10. Statistical analysis 33

Ⅲ. RESULTS 33

1. UPLC-Q-TOF MS analysis of Jangkanghwan 33

2. Body weight analysis of mice 36

3. Colon length and weight analysis of mice 36

4. Liver, spleen, kidney, and testis index analysis of mice 39

5. Colon H&E section analysis of mice 39

6. Disease activity index data analysis of mice 42

7. Cytokine level of TNF-α, IFN-γ, IL-1β, and IL-6 in the serum of mice 42

8. qPCR analysis of murine colon tissue 44

9. Colon tissue protein expression analysis of mice 47

10. NGS analysis of mice 49

Ⅳ. DISCUSSION 52

Ⅴ. CONCLUSION 57

CHAPTER 2. Protective effect of Jangkanghwan (Korean traditional health food) on lipopolysaccharide-induced disruption of the colonic epithelial barrier 58

Ⅰ. INTRODUCTION 59

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 61

1. Introduction of Jangkanghwan 61

2. Animal experimental design 62

3. Diarrhea after LPS administration 64

4. Bacterial translocation assay 64

5. Determination of the intestinal mucosa permeability 64

6. Serum inflammatory cytokine test 65

7. H&E staining of colon tissue 65

8. mRNA expression determination using RT-qPCR 65

9. Protein expression determination by Western blotting 67

10. Statistical analysis 68

Ⅲ. RESULTS 68

1. Food intake analysis 68

2. Organ index analysis 69

3. Diarrhea after LPS administration 69

4. Serum inflammatory cytokine analysis 73

5. Colon bacteria translocation analysis 73

6. Colonic permeability analysis 75

7. Colon histopathological observation 75

8. mRNA and protein expression analysis of colon tissue 79

Ⅳ. DISCUSSION 79

Ⅴ. CONCLUSION 85

CHAPTER 3. Based on network pharmacology and cell experiment to explore the molecular mechanism of anti-ulcerative colitis properties of Jangkanghwan (Korean traditional health food) 87

Ⅰ. INTRODUCTION 88

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 90

1. Chemical composition and target collection 90

2. Identification of differentially expressed genes in ulcerative colitis 91

3. Screening and analysis of Jangkanghwan and UC intersection targets 91

4. Bioinformatic analysis 92

5. Cell culture 92

6. Jangkanghwan's cytotoxicity test 92

7. Live/dead cell staining 93

8. Cell enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 93

9. mRNA expression determination using RT-qPCR 94

10. Protein expression determination by Western blotting 94

11. Statistical analysis 96

Ⅲ. RESULTS 96

1. Compound-Target Network analysis 96

2. Identification of candidate Targets for Jangkanghwan against UC 102

3. Analysis of GO enrichment of Jangkanghwan target genes for alleviating colitis 107

4. Gene-pathway network analysis 109

5. Effects of Jangkanghwan on cell viability 109

6. Morphological changes and live/dead cell staining of CCD841CoN cells 111

7. Effects of Jangkanghwan on MPO, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-1β, and, IL-10 levels of cell 111

8. Effects of Jangkanghwan on mRNA and protein expression in the CCD841CoN cell 115

Ⅳ. DISCUSSION 115

Ⅴ. CONCLUSION 123

CHAPTER 4. Inhibitory effect of pheophorbide A on Lipopolysaccharide-induced inflammation in RAW264.7 cells via NF-κB pathway 124

Ⅰ. INTRODUCTION 125

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 127

1. Sample preparation 128

2. Cells cultures 128

3. Cell viability 128

4. Cell morphology observation 129

5. Measurement of NO production 129

6. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 130

7. mRNA expression determination using RT-qPCR 130

8. Statistical analysis 131

Ⅲ. RESULTS 131

1. The effect of pheophorbide A on the viability of RAW264.7 cells 133

2. The effect of pheophorbide A on the morphology of RAW264.7 cells 133

3. The effect of pheophorbide A on NO production in RAW264.7 cells 135

4. Effect of pheophorbide A on IL-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, and IFN-γ levels 138

5. Effect of pheophorbide A on IL-1β, IL-6, IL-10, iNOS, TNF-α, COX-2, NF-κB, and IκB-α mRNA expression 138

Ⅳ. DISCUSSION 140

Ⅴ. CONCLUSION 145

REFERENCES 147

ABSTRACT IN KOREAN 169

CHAPTER 1 11

Table 1. Disease activity index assessment standards 29

Table 2. Primer sequences list 31

Table 3. Components of Jangkanghwan 35

Table 4. Index of liver, kidney, testis, and spleen in mice 40

Table 5. Phylum level intestinal microbiota of DSS-induced mice 50

Table 6. Bifidobacterium, Lactobacillus, and Akkermansia genus level intestinal microbiota of DSS-induced mice 51

CHAPTER 2 11

Table 7. Primer sequence list of colon tight junctions genes in BALB/c mice that underwent LPS-induced colonic epithelial injury 66

Table 8. Organ indexes of BALB/c mice that underwent LPS-induced colonic epithelial injury 71

Table 9. Bacterial translocation in the liver, spleen, and mesenteric lymph node 76

CHAPTER 3 11

Table 10. Primer sequences list 95

Table 11. The active pharmaceutical ingredients in Jangkanghwan selected for analysis 97

Table 12. IL-6, CCL2, MMP9, IL-1β, ICAM1, PTGS2, VCAM1, and c-fos mRNA expression in the CCD841CoN cell 116

CHAPTER 4 12

Table 13. Primer sequences list 132

Table 14. NO production of LPS-induced RAW264.7 cell 137

Table 15. IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, and IFN-γ expression level in LPS-induced RAW264.7 cell 139

 본 논문은 in vivo 및 in vitro 를 통해 한국 전통건강식품인 장강환이 대장에 미치는 보호 효과를 검증하였으며, 최종적으로 장강환이 대장에서 염증 억제 효과와 그의 기전을 확인하였다. 본 논문은 3 부분 (part)으로 구성되었다.

Part 1 은 chapter 1 과 2 로 나누어져 있으며, 장강환의 성분분석과 동물체내에서의 작용에 대하여 연구를 하였다. 장강환은 대장건강식품으로서 Atractylodes macrocephala koidzumi (백출), radish leaves (무청), Viscum album var. coloratum (겨우살이), dried Zingiber officinale Roscoe (건강)성분 등 12 가지로 구성된 혼합물이다. UPLC-Q-TOF MS 분석에 의하면 장강환은 주요하게 pheophorbide A, nabumetone alcohol, dehydrocostus lactone, plantamajoside, kaempferol 3, 7-dirhamnoside, quercetin 3-D-glucuronide 및 viscumneoside III 등의 활성물질이 있는 것으로 나타났다. Chapter 1 의 실험결과 마우스 모델에서 dextran sulfate sodium (DSS)이 유도하는 궤양성 대장염 (UC)에 대한 장강환의 예방 효과가 연구되었으며 장강환이 마우스에서 DSS 로 인한 염증의 손상을 감소시킬 수 있음을 발견하였다. 장강환은 마우스의 체중감소를 완화시키고, 회복기에 체중증가를 촉진시켜주며, 대장길이 단축량 및 대장무게를 감소시킬 수 있을뿐만 아니라 장강환은 마우스의 disease activity index (DAI) 도 조절하였다. 장강환은 전염증인자(interleukin (IL)-6, IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), cyclooxygenase-2 (COX-2), and nuclear factor kappa-B (NF-κB)가 혈청에서의 함량과 조직에서의 발현량을 감소시켰으며, 반대로, 혈청과 조직에서 IL-10 및 inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase-α（IκB-α）의 함량과 발현량을 증가시켰다. 그리고 대장조직에서 대장염증 바이오마커인 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)과 macrophage inflammatory protein-3α (MIP-3α)의 mRNA 발현량을 감소시켰다. NGS 분석에 의하면 장강환 그룹에서 Bacteroidetes 문 (phylum)은 감소시키고 Firmicutes 문 은 증가하였으며 유익한 박테리아인 Bifidobacterium, Lactobacillus 및 Akkermansia 속 등도 증가시키는 것으로 나타났다.

Chapter 2 에서는 lipopolysaccharide (LPS)가 유도하는 대장상피기능 장애가 있는 BALB/c 마우스에게 장강환을 투여하여 마우스의 체중과 음식섭취량을 측정하였다. Colonic paracellular permeability, 혈청 염증사이토카인, bacterial translocation 등 지표를 이용하여 장강환이 마우스 대장 상피기능에 대한 작용을 평가하였으며, 대장상피조직에서 발현하는 tight junction (TJ) 관련 유전자 occluding, claudin, zonula occludens (ZOs) proteins 과 junction adhesion molecules (JAM)의 발현량을 qPCR 과 western blot 을 이용하여 확인하였다. 실험 결과 장강환은 마우스의 간장, 비장, 및 장막림프절 조직의 부종을 완화하고, LPS 주사로 인한 마우스의 식욕부진과 설사를 감소시키는 것으로 나타났다. 장강환은 마우스의 음식 섭취량은 LPS 그룹의 3.7 ± 0.15 g/day 로부터 4.7 ± 0.21 g/day 로 증가하고 마우스의 대변 수분의 함량을 LPS 그룹 마우스보다 13.8 ± 1.23% 감소시켰다. 장강환은 LPS 로 인한 마우스의 염증반응을 감소하고, 대장의 상피세포를 보호하고, Fluorescent macromolecules 의 투과성은 LPS 그룹의 4 분의 1 이며, 대장조직에서 TJ 와 연관된 유전자의 mRNA 와 단백질의 발현량을 높이는 효과를 나타내었다.

Part 2 (chapter 3)에서는 bioinformatic 기술을 이용하여 network pharmacology 및 장강환이 궤양성 대장염에 미치는 영향에 대한 세포 실험을 기반으로 pathway 및 기전을 연구하였다. 본 연구에서는 장강환의 활성성분을 수집하고 Gene expression omnibus (GEO) 데이터베이스를 통해 건강한 사람과 UC 를 가진 사람 사이에 차별적으로 발현되는 유전자를 분석하고 UC targets 을 얻었다. 마지막으로, 교차 targets 유전자를 얻기 위해 장강환과 질병 targets 유전자들을 배치하였다. 교차 유전자는 Gene ontology (GO) 과 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)경로의 밀집 분석을 수행했으며 그 결과를 세포실험을 통해 검증되었다. 참고문헌검색, Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)데이터 검색을 통하여 장강환의 79 개의 활성성분 및 264 개의 활성 성분 targets 을 확인하고, UC 에서 발현의 차이를 보이는 유전자 910 개(P value＜0.005, |log2(fold change)| ＞1)를 선별하여 39 개의 교차 유전자를 선정하였다. 삼백초 중의 Quercetin 은 24 개의 교차 유전자와 잠재적 작용이 있으며, PTGS2 은 35 개 유효성분과 상호작용이 있었다. 교차유전자의 functional annotation 은 biological regulation, cellular process 와 binding 등과 연관이 있었다. 152 개의 밀집경로 결과 중 TNF 신호전달경로에서 IL-6, chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), matrix metallopeptidase 9 (MMP9), IL-1β, intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1), PTGS2, vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM1) 및 FOS 가 장강환이 항 대장염 억제 효과를 발휘하는 주요 경로 및 targets 유전자일 수 있다. 그리고 In vitro 실험을 통하여 CCD841CoN cell 항염증 targets 에 대한 장강환의 효과를 검증하였다.

Part 3 은 chapter 4 부분이며, 여기서는 장강환 중 함량이 제일 많게 검출된 활성화합물 pheophorbide A(phA)가 LPS 로 유도된 RAW264.7 cell 의 염증을 완화시키는 것을 증명하였다. 이 실험에서는 laser stimulation 이 없는 세 농도의 phA 를 사용하여 RAW264.7 cell 에서 LPS 로 인한 염증의 완화 효과를 연구하였다.

세포 형태, cell viability, 세포 상층액중 사이토카인 함량 및 NO 함량 측정, 세포 내 염증 관련 유전자들의 mRNA 발현량의 측정을 통하여 10 nM, 15 nM, 20 nM 농도의 phA 가 LPS 로 인한 세포손상을 억제하는 것을 발견하였고, 세포에서 NO 및 전염증인자 인 IL-1β, IL-6, FN-γ 과 TNF-α 의 분비를 감소시켰으며, 항염증인자 IL-10 의 함량을 증가시켰다. 한편 phA 는 RAW264.7 cell 에서 항염인자 유전자인 IκB-α 의 발현을 증가시키고, NF-κB 경로의 활성화를 억제하여 염증을 억제하였다. 전반적으로, phA 가 laser 에 의해 자극되지는 않았지만, 여전히 우수한 항염증 효과를 가지며 NF-κB 경로로 인한 염증 손상을 억제하여 phA 의 향후 개발 및 활용에 대한 새로운 아이디어를 제공했다.