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Title Page

Contents

List of Abbreviation 12

Abstract 15

Chapter Ⅰ. The effect of FGF11 on cell proliferation of U2OS cells 17

1. Introduction 18

1.1. Fibroblast growth factor family 18

1.2. Intracrine fibroblast growth factor family: Fibroblast growth factor 11 20

1.3. Human bone osteosarcoma epithelial cells (U2OS cells) 21

1.4. Cell proliferation and cell cycle 22

1.5. p53 and Mdm2 25

2. Materials and Methods 27

2.1. Cell culture 27

2.2. Preparation of plasmids 27

2.3. Transient transfection with plasmid or small interfering RNA (siRNA) 27

2.4. Western blot analysis 28

2.5. RNA preparation and Real-time quantitative reverse transcription PCR (real-time RT-PCR) 29

2.6. Cell proliferation by live imaging 30

2.7. Apoptosis assay by flow cytometry 30

2.8. Cell cycle assay by flow cytometry 30

2.9. Immunoprecipitation 31

2.10. Statistical Analysis 32

3. Results 33

3.1. FGF11 knockdown inhibits cell proliferation 33

3.2. FGF11 knockdown arrests the S and G2/M phases of the cell cycle 36

3.3. FGF11 knockdown increases proteins expression of p27 and p53 39

3.4. Inhibition of cell proliferation by FGF11 knockdown is regulated by two pathways: p27 and p53 43

3.5. FGF11 knockdown arrests the cell cycle by regulating p53. 45

3.6. FGF11 knockdown increased proteins levels of Mdm2 47

3.6. FGF11 interacts with Mdm2 49

4. Discussion 51

Chapter Ⅱ. The effect of FGF11 on cisplatin-induced cell death of U2OS cells 56

1. Introduction 57

1.1. Osteosarcoma and Cisplatin 57

1.2. Cisplatin in cancer therapy: Molecular mechanisms of action 58

2. Materials and Methods 62

2.1. Cell culture and cisplatin treatment 62

2.2. Transient transfection with plasmid or siRNA 62

2.3. Western blot analysis 62

2.4. Apoptosis assay by flow cytometry 63

2.5. Live imaging analysis of apoptosis and necrosis 64

2.6. Intracellular ROS detection 64

2.7. Statistical analysis 65

3. Results 66

3.1. FGF11 knockdown increases cisplatin-induced apoptosis of U2OS cells 66

3.2. FGF11 knockdown and cisplatin induce ROS production 71

3.3. Cisplatin induces ROS-mediated apoptosis 73

3.4. Cisplatin induces p53-mediated apoptosis 77

4. Discussion 80

5. Conclusion 84

6. Reference 85

List of Figures

Chapter 1 9

Fig. 1. Evolutionary relationships within the human FGF gene family 19

Fig. 2. The canonical cell cycle and its main regulatory mechanisms 24

Fig. 3. The degradation of p53 and its major E3 ligase Mdm2 26

Fig. 4. Observation of cell proliferation by knockdown of FGF11 in U2OS cells using live imaging analysis 34

Fig. 5. Observation of cell proliferation by overexpression of FGF11 in U2OS cells using live imaging analysis 35

Fig. 6. Assessment of cell death levels by knockdown of FGF11 in U2OS cells using flow cytometry 37

Fig. 7. Assessment of cell cycle by knockdown of FGF11 in U2OS cells using flow cytometry 38

Fig. 8. Effect on mRNA transcript levels related to cell cycle by knockdown of FGF11 in U2OS cells using real-time RT-PCR 41

Fig. 9. Effect on the protein levels related to cell cycle by knockdown of FGF11 in U2OS cells using western blot analysis 42

Fig. 10. Effect on double knockdown of cell cycle inhibitor and FGF11 in U2OS cells using siRNA 44

Fig. 11. Observation of cell proliferation by knockdown of FGF11 and p53 in U2OS cells using live imaging analysis 46

Fig. 12. Effect on the expression of Mdm2 by knockdown of FGF11 in U2OS cells using western blot analysis 48

Fig. 13. Interaction of FGF11 with Mdm2 in U2OS cells by immunoprecipitation 50

Fig. 14. Mechanism of cell proliferation inhibition in FGF11 knockdown U2OS cells 55

Chapter 2 10

Fig. 1. Molecular mechanisms of cisplatin in cancer treatment 60

Fig. 2. The p53-mediated DNA damage response 61

Fig. 3. Assessment of cell death levels upon cisplatin treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using live imaging analysis 68

Fig. 4. Assessment of cell death levels upon cisplatin treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using flow cytometry 69

Fig. 5. Effect on protein levels related to apoptosis upon cisplatin treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using western blot analysis 70

Fig. 6. Assessment of ROS levels upon cisplatin treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using CM-H2DCFDA assay 72

Fig. 7. Assessment of ROS levels upon cisplatin and NAC treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using CM-H2DCFDA assay 74

Fig. 8. Observation of cell death upon cisplatin and NAC treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using live imaging analysis 75

Fig. 9. Effect on protein levels related to apoptosis upon cisplatin and NAC treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using western blot analysis 76

Fig. 10. Effect on p53 protein levels upon cisplatin treatment after knockdown of FGF11 in U2OS cells using western blot analysis 78

Fig. 11. Effect on protein levels related to apoptosis upon cisplatin treatment after knockdown of FGF11 and p53 in U2OS cells using western blot analysis 79

Fig. 12. Cisplatin-induced apoptosis mechanism by knockdown of FGF11 83

초록보기

 Fibroblast growth factor 11 (FGF11)은 FGF family 중 intracrine FGF에 속합니다. 암에서의 FGF11의 역할은 다양한 종류의 암에서 관찰되었으나, FGF11의 작용 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않았습니다. 본 연구는 U2OS 세포에서의 세포 증식과 시스플라틴 유발 세포 사멸에서 FGF11의 기능을 파악하고, 이에 대한 조절 메커니즘을 조사합니다. Chapter 1에서는 U2OS 세포에서 siRNA을 이용하여 FGF11 발현을 억제하면 세포 증식이 억제된다는 결과를 얻었습니다. U2OS 세포에서 siRNA을 이용하여 FGF11 발현을 억제하면 세포 증식이 억제된다는 결과를 얻었습니다. 더불어, FGF11과 p53의 E3 리가제인 Mdm2 간의 상호 작용 단백질로서 Mdm2를 확인함으로써 FGF11이 Mdm2와 p53의 관계를 통해 세포 증식을 조절할 가능성을 시사합니다. 즉, FGF11의 발현 억제가 p53과 p27을 표적으로 삼아 세포 주기 진행을 억제함으로써 U2OS 세포의 세포 증식을 조절할 수 있음을 시사합니다. Chapter 2에서는 FGF11 발현 억제 후 시스플라틴 처리로 인한 세포 사멸 수준의 변화를 확인했습니다. 시스플라틴은 골육종 치료의 표준 화학요법으로 사용되지만, 다양한 부작용으로 임상적인 응용이 제한됩니다. 그래서 시스플라틴 용량을 늘리지 않고도 치료 효능을 향상하는 것이 중요합니다. FGF11의 발현 억제는 U2OS 세포에서 시스플라틴 유도된 세포 사멸을 증가시켰습니다. 이러한 세포 사멸 증가는 Live imaging 및 Flow cytometry 분석을 통해 확인되었으며, 분자 수준에서의 조사를 위해 western blot 및 실시간 RT-PCR을 실시한 결과 세포 사멸 관련 단백질 발현이 증가했습니다. 이러한 결과는 FGF11 발현의 억제가 시스플라틴에 더 민감한 반응을 나타냄을 시사합니다. U2OS 세포에서 시스플라틴 유도 세포 독성의 기전을 이해하기 위해 ROS 수준을 측정한 결과, 시스플라틴 처리 시 ROS 생성이 증가하며 FGF11 발현이 억제된 후 시스플라틴 처리 시 더욱 증가함을 확인했습니다. 시스플라틴 유도 세포 사멸에서 ROS의 역할을 확인하기 위해 ROS 억제제인 NAC를 처리한 결과, 시스플라틴 유도 세포 사멸이 유의하게 억제되었습니다. 이는 U2OS 세포에서 시스플라틴 유도 세포 사멸의 중요 인자가 ROS에 의해 유발된다는 것을 시사합니다. 또한, 시스플라틴 매개 세포 사멸이 p53의 활성화를 유발한다는 점을 고려할 때, Chapter 1에서 확인된 것처럼 FGF11 발현 억제는 p53의 발현이 증가함을 보여주었습니다. 시스플라틴 유도 세포 사멸의 메커니즘에 대한 p53의 역할을 확인하기 위해 p53의 siRNA 처리 결과, p53 발현 억제로 시스플라틴 유도 세포 사멸이 유의하게 억제되었습니다. 따라서 FGF11 발현 억제는 U2OS 세포에 대한 시스플라틴의 항암 효과를 강화시키며, 이러한 세포 사멸 조절에 ROS와 p53이 관여한다는 결과를 확인했습니다. 결론적으로, 본 연구는 FGF11이 U2OS 세포의 세포 주기 조절에 관여하며, 시스플라틴으로 유도되는 세포 사멸에도 FGF11이 ROS 생성과 p53의 활성화를 통해 관여한다는 것을 시사합니다.

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