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ABSTRACT

Contents

1. Introduction 10

2. Materials and Methods 15

2.1. Preparation of chemicals 15

2.2. Marine mysids culture 15

2.3. Acute toxicity test 15

2.4. RNA extraction and sequencing 16

2.5. De novo assembly and functional annotation 16

2.6. Expression profiling and differential gene expression analysis 17

2.7. Experimental validation by real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) 18

2.8. Protein extraction and measurement of oxidative parameters 18

2.9. Acridine orange (AO) and fast green (FG) staining 22

2.10. Statistical analysis 22

3. Results 26

3.1. Toxic effects of biocides in N. awatschensis 26

3.2. Transcriptome profiling of biocides in N. awatschensis 30

3.2.1. Differential gene expression of N. awatschensis exposed to biocides 30

3.2.2. Gene ontology (GO) enrichment analysis of N. awatschensis exposed to biocides 40

3.2.3. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of N. awatschensis exposed to biocides 45

3.2.4. Stress-related DEGs of N. awatschensis exposed to biocides 49

3.2.5. Validation of transcriptome profiles by qRT-PCR 53

3.3. Oxidative stress parameter measurement of N. awatschensis exposed to biocides 55

3.4. DNA damage measurement of N. awatschensis exposed to biocides 67

4. Discussion 70

5. Conclusion 75

References 76

국문초록 81

List of Tables

Table 1.1. Concentrations of diuron and cybutryne detected in the environment. 14

Table 2.1. Functional annotation summary 24

Table 2.2. Primers of overlapping genes for validation 25

Table 3.1. 96 h-LC₅₀ values from 96 h acute toxicity tests of diuron and cybutryne on aquatic organisms 29

Table 3.2. List of stress-related DEGs in N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne 52

List of Figures

Fig. 1.1. Graphical abstract 13

Fig. 2.1. The chemical structures of diuron and cybutryne 23

Fig. 3.1. Survival rates of N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne 27

Fig. 3.2. Concentration-response curves of N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne A) is concentration-response curve of N. awatschensis at 96 h after exposure to diuron. B) is... 28

Fig. 3.3. Venn diagram of N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne 31

Fig. 3.4. Venn diagram of N. awatschensis exposed to 100 μg/L and 1000 μg/L of diuron 33

Fig. 3.5. Networks of overlapping genes in 100 μg/L and 1000 μg/L of diuron 34

Fig. 3.6. Venn diagram of N. awatschensis exposed to 2 μg/L and 20 μg/L of cybutryne 36

Fig. 3.7. Networks of overlapping genes in 2 μg/L and 20 μg/L of cybutryne 37

Fig. 3.8. Volcano plots of N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne 39

Fig. 3.9. GO enrichment analysis in N. awatschensis exposed to diuron 42

Fig. 3.10. GO enrichment analysis in N. awatschensis exposed to cybutryne 44

Fig. 3.11. KEGG pathway analysis in N. awatschensis exposed to diuron 46

Fig. 3.12. KEGG pathway analysis in N. awatschensis exposed to cybutryne 48

Fig. 3.13. Heatmap showing stress-related DEGs in N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne 51

Fig. 3.14. Correlation of relative fold changes between qRT-RCR and RNA-seq results of N. awatschensis exposed to diuron and cybutryne 54

Fig. 3.15. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity of N. awatschensis exposed to diuron. 56

Fig. 3.16. Glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activity of N. awatschensis exposed to diuron. 58

Fig. 3.17. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity of N. awatschensis exposed to cybutryne. 60

Fig. 3.18. Glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activity of N. awatschensis exposed to cybutryne. 62

Fig. 3.19. Glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) contents of N. awatschensis exposed to diuron. 64

Fig. 3.20. Glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) contents of N. awatschensis exposed to cybutryne. 66

Fig. 3.21. AO and FG staining of N. awatschensis exposed to control, DMSO, and different concentrations of diuron and cybutryne for 24 h. Scale bar is 1000 μm, n＝3. 68

Fig. 3.22. Red/Green ratio in N. awatschensis exposed to control, DMSO, and different concentrations of diuron and cybutryne for 24 h. The standard error of the mean is shown by... 69

초록보기

 선박 사용의 효율성을 높이기 위해 선박 방오 도료의 사용이 증가하고 있으며, 선박 방오 도료에는 diuron과 cybutryne 등 다양한 살생물제들이 첨가된다. 그러나 이러한 살생물제들은 비표적 생물에게 독성 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 비표적 생물 중 무척추동물에 대한 연구는 부족한 실정이다. 본 연구에서는 선박 방오 도료에 첨가되는 살생물제인 diuron과 cybutryne이 대표적인 비표적 생물인 해산 곤쟁이에 미치는 독성 영향과 기작을 규명하고자 했다. 급성 독성 시험을 통해 해산 곤쟁이에 대한 살생물제의 독성 영향을 평가하고, RNA sequencing 분석 기법을 통해 독성 메커니즘을 조사했다. 급성 독성 시험 결과, diuron과 cybutryne의 96시간 반수치사 농도 (96 h-LC50) 값은 각각 1612 및 101 μg/L로 cybutryne이 diuron보다 해산 곤쟁이에게 더 독성이 있는 것으로 나타났다. 살생물제에 대한 독성 메커니즘을 확인하기 위해 RNA sequencing을 사용하였다. Gene ontology enrichment 분석에 따르면 세포 골격 유전자가 diuron과 cybutryne에 의해 하향 조절되었다. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway 분석에서는 junction pathway와 hippo signaling pathway가 유의미하게 하향 조절되었다. 단백질 수준에서는 항산화 효소의 활성과 glutathione (GSH) 함량이 살생물제에 노출되는 시간에 따라 증가하는 경향을 보였지만 24시간이 지나면 감소했다. 반면 malondialdehyde (MDA)는 노출 시간에 따라 증가하였다. 종합하면, 이 결과는 diuron과 cybutryne에 대한 해산 곤쟁이의 독성 메커니즘을 최초로 입증하고 비표적 생물 중 무척추동물에 대한 살생물제 독성 효과를 더 잘 이해할 수 있는 기반을 제시했다.

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