본문 바로가기 주메뉴 바로가기
22대 대한민국 국회 국회정보길라잡이 국회의원검색
회원가입 로그인
HOME

정보검색

소장정보 검색

국회도서관 홈으로 정보검색 소장정보 검색
결과 내 검색 동의어 포함
결과 내 검색 동의어 포함

-

목차보기

Title Page

ABSTRACT

Contents

Chapter 1. Introduction 13

1.1. Therapeutic approaches for type 2 diabetes and their constraints 13

1.2. The necessity for gene regulators responsive to T2DM-related molecules 19

1.2.1. Managements of T2DM through eLBPs 20

1.3. Systems for controlling gene expression via nucleic acids 22

1.3.1. Regulation of gene expression using genetically encoded biosensors 22

1.3.2. RNA-based biosensors: advantages over transcription factor-based biosensors 24

1.4. Research goals and approach 27

Chapter 2. Materials and Methods 28

2.1. Materials 28

2.1.1. Bacterial strains, culture media and conditions 28

2.1.2. Vectors and primers 28

2.1.3. Enzymes and other reagents 28

2.2. Methods 31

2.2.1. Plasmids preparation 31

2.2.2. NUPACK 31

2.2.3. In vitro selection of RNA aptamers 31

2.2.4. In vivo fluorescence measurements 34

2.2.5. FACS-based In vivo selection for RNA regulators 35

Chapter 3. Results and Discussion 36

3.1. Design of metformin or ImP-responsive gene regulator 36

3.2. In vitro selection of RNA aptamers for metformin or ImP 39

3.2.1. Design of aptamer library for in vitro selection 40

3.2.2. In vitro Capture-SELEX 46

3.3. Control test to validate the feasibility of our design 52

3.4. Cloning of aptamer library in STAR plasmids 52

3.5. FACS-based in vivo selection 56

3.5.1. Optimization of conditions for FACS-based in vivo selection 56

3.5.2. Enrichment of ligand-responsive RNA regulators 58

3.6. Characterization of metformin or ImP-responsive RNA-based gene regulators 67

Chapter 4. Conclusion 69

Reference 71

국문 초록 78

List of Tables

Table 1. Characteristic of major drugs for type 2 diabetes mellitus. 16

Table 2. List of engineered LBPs for type 2 diabetes mellitus. 23

Table 3. List of major oligonucleotides. 30

Table 4. Sequences and properties along the length of docking sequences and capture oligos. 43

Table 5. The sequence of CO, DS, and primers for Capture-SELEX. 44

Table 6. Capture-SELEX round conditions for each compound. 50

List of Figures

Figure 1. Trends in the prescription of antidiabetic medications. 17

Figure 2. Visualization of the mechanism through which imidazole propionate undermines the glucose-lowering efficacy of metformin. 18

Figure 3. Computational design of synthetic RNA regulatory systems. 26

Figure 4. Schematic illustration of design for gene regulator in modulating gene expression in the presence or absence of ligands. (a) Designs of STAR and target plasmids and (b) Mechanisms of action for metformin or ImP-responsive gene regulators. 38

Figure 5. Design of library for Capture-SELEX. 42

Figure 6. Ensemble pair fraction plots of the complex with DS and primers. (a) Forward primer/DS and (b) Reverse primer/DS. 45

Figure 7. Overview of the Capture-SELEX process. 48

Figure 8. Aptamer interaction mechanism with and without ligand in Capture-SELEX. 49

Figure 9. Eluted RNA profiles for metformin or ImP. (a) For metformin and (b) For ImP. * means no RNA detected. 51

Figure 10. Fluorescence measurements of plasmids in the presence and absence of STAR, and with added sequences complementary to STAR. (a) Fold activation calculated from fluorescence characterization and (b) Flow cytometry histogram a target RNA expressing sfGFP in the... 53

Figure 11. Illustration of the aptamer pool integration into a STAR plasmid using a type IIs enzyme in the cloning process. 54

Figure 12. Sequencing results of the constructed gene regulator. 55

Figure 13. Overview of FACS-based in vivo selection process. 59

Figure 14. Flow cytometry histogram of metformin-responsive gene regulator by ligand concentration and incubation time (a) 4 h incubation (b) 18 h incubation. 60

Figure 15. Flow cytometry histogram of imidazole propionate-responsive gene regulator by ligand concentration and incubation time (a) 4 h incubation (b) 18 h incubation. 61

Figure 16. Fold activation of gene regulator under different conditions, computed from the geometric mean value derived from flow cytometry measurements (a) For metformin (b) For ImP. 62

Figure 17. Flow cytometry histogram for each round of FACS-based in vivo selection of 5' library for metformin. Sorting range is shown in green for positive selection and gray for negative selection. 63

Figure 18. Flow cytometry histogram for each round of FACS-based in vivo selection of 3' library for metformin. Sorting range is shown in green for positive selection and gray for negative selection. 64

Figure 19. Flow cytometry histogram for each round of FACS-based in vivo selection of 5' library for ImP. Sorting range is shown in green for positive selection and gray for negative selection. 65

Figure 20. Fold activation of gene regulators for each round of in vivo selection. (a) 5' library and (b) 3' library for metformin (c) 5' library for ImP. Fold activation was calculated as the ratio of the mean fluorescence intensity (MFI) with ligand to the MFI without ligand measured by... 66

초록보기

 제 2 형 당뇨병은 전체 당뇨병 중 90%이상을 차지하며 모든 연령대에서 나타나는 흔한 질병이다. 제 2 형 당뇨병의 치료로는 경구 투여 약물인 메트포르민이 주로 제 1 차 약제로 사용된다. 간으로 이동한 메트포르민은 간에서 adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)의 T172 를 인산화시켜 간에서의 포도당 합성을 저해해 혈당을 낮춘다. 하지만, 최근 연구에서 장내 미생물에 의해 생산되는 대사산물인 이미다졸 프로피온산이 메트포르민의 활성을 저해한다는 것이 보고됐다. 이미다졸 프로피온산은 kinase 인 Akt 의 인산화를 매개하고 이는 AMPK의 S485 를 인산화시키면서 메트포르민의 AMPK 활성화 기작을 억제한다. 추가로 같은 저자들은 이미다졸 프로피온산가 mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1)의 활성화를 매개로 insulin receptor substrate (IRS)의 세린의 인산화를 유도하여 IRS 의 분해를 억제함으로써 인슐린 신호 전달 및 내당성을 손상시킨다는 것을 입증했다. 이러한 이미다졸 프로피온산은 당뇨병 전단계 및 당뇨병이 있는 피험자의 혈청에서 그 수치가 증가하며, 메트포르민 투여 시 더 증가하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 장 내에서의 이미다졸 프로피온산의 과생성은 제 2 형 당뇨병에 부정적인 영향을 미치며, 이를 위한 해결방법은 아직 보고된 바가 없다. 메트포르민 투여와 함께 이미다졸 프로피온산의 높아진 농도를 낮추기 위해서 장 내에서 메트포르민 및 이미다졸 프로피온산의 농도를 직접 감지하여 이미다졸 프로피온산의 분해가 실시간으로 이뤄지도록 하는 방법은 이러한 문제를 해결하기에 유망하다. 이를 위해서는 메트포르민 및 이미다졸 프로피온산 농도 감지, 이미다졸 프로피온산 생산 미생물 균주 발굴, 이미다졸 프로피온산 분해 효소 발굴 및 개량 등의 선행연구가 필요하며, 이를 종합하면 더 효율적인 제 2 형 당뇨병 치료제의 개발이 가능해질 것이다. 유전자에 암호화된 바이오센서는 특정 화합물에 의존하여 원하는 유전자의 발현을 조절하는 능력으로, 다양한 분야에 활용되어왔다. 그 중 RNA 기반의 바이오센서는 설계의 용이성, 높은 프로그램화, 낮은 세포 자원 사용 등의 장점으로 최근 합성생물학 분야에서 널리 사용되고 있다. 본 연구에서는 앞서 언급한 각 연구들에 유용하게 사용될 수 있는 메트포르민, 이미다졸 프로피온산 의존 RNA 기반의 인공적인 유전자 발현 도구를 개발한다. 이 유전자 발현 조절 도구는 RNA 압타머와 전사 종결을 조절하는 STAR 라고 하는 작은 RNA 분자로 구성되어 있다. RNA 압타머의 개발을 위한 라이브러리는 무작위 서열 영역에 STAR 활성을 막기 위한 STAR 에 상보적인 서열이 추가되어 설계되었다. 라이브러리의 다양한 서열 중 메트포르민과 이미다졸 프로피온산에 결합하는 압타머 서열은 시험관 내 인공진화 방법을 통해 농축되었다. 총 15 회에 걸쳐 선별 과정이 진행되었으며, 그 중 가장 많이 회수된 15 회차의 메트포르민 반응 RNA 압타머, 13 회차의 이미다졸 프로피온산 반응 RNA 압타머는 DNA 로 전환되어 STAR 서열이 존재하는 플라스미드에 통합되었다. STAR 구조에 대한 압타머 서열의 영향을 고려하여, 압타머는 STAR 의 5'이나 3' 혹은 아예 분리되어 위치했다. 이렇게 구축된 유전자 발현 조절 암호화 플라스미드는 대장균에 도입되어 생체 내에서 메트포르민 혹은 이미다졸 프로피온산에 반응하는 기능적인 도구가 선별되도록 하였다. 우리는 우선 생체 내 선별을 위해서 유전자 발현 도구 라이브러리의 형광을 측정하여, 화합물 농도에 따라 기본적인 STAR 의 형광 변화에 영향을 받지 않으면서, 화합물 유무에 따른 형광 차이가 크게 나타나는 최적의 화합물 농도와 배양시간을 선택했다. 이를 통해 50 mM 의 메트포르민 또는 100 mM 의 이미다졸 프로피온산 농도로 4 시간 배양하는 것이 최적의 조건임을 알아냈다. 이후 FACS 를 통해 화합물 농도의 유무에 따라 형광 세기 차이를 보이는 세포만이 분리되어 회수되었다. 이러한 과정의 반복으로 생체 내에서 메트포르민 또는 이미다졸 프로피온산에 의존하여 유전자가 발현되는 유전자 발현 조절 도구가 성공적으로 농축될 수 있다. 이렇게 개발된 유전자 발현 조절 도구는 메트포르민 또는 이미다졸 프로피온산에만 특이적으로 반응하는지, RNA 압타머와 화합물 사이의 친화력이나 민감도는 어느 정도인지 등이 조사될 수 있고, 두 유전자 발현 조절 도구와 다양한 STAR 변이체를 활용하여 논리 회로가 구축될 수 있다. 이러한 과정을 통해 개발된 회로는 메트포르민의 치료 효능 저해 현상 진단, 이미다졸 프로피온산 생산 미생물 규명 및 분해 효소 발굴, 개발 연구에서 유용하게 활용될 수 있다. 또한 이러한 연구 개발들은 미생물 치료제에 통합되어 제 2 형 당뇨병 치료를 위한 새로운 길을 제시할 수 있다.

추천서가 (다양한 추천 자료를 만나보세요)

권호기사보기

권호기사 목록 테이블로 기사명, 저자명, 페이지, 원문, 기사목차 순으로 되어있습니다.
기사명 저자명 페이지 원문 기사목차