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Title Page

Abstract

Contents

Chapter 1. Introduction 14

Chapter 2. Materials and Methods 24

2.1. Cell cultures 24

2.2. Virus 28

2.3. Chemicals and media components 35

2.4. Western blot analysis 38

2.5. Production of mRFP-EGFP-LC3B stably expressing cell lines 43

2.6. Immunofluorescence 46

2.7. Production of ATG5 KO cell lines 48

2.8. In vitro cell viability assay 53

2.9. Plaque assay 53

2.10. Statistical analyses 56

Chapter 3. Results 57

3.1. Identification of autophagic flux in HeLa cells in response to nutrient deprivation 57

3.2. The cleavage of the SQSTM1/p62 protein is induced independently of the autophagic flux pathway in HeLa cells infected with CVB3 at a high MOI 59

3.3. CVB3 infection does not trigger a complete autophagic flux, including the formation of autophagosomes 62

3.4. CVB3 infection does not affect Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway phosphorylation 68

3.5. Autophagosome formation is not essential for CVB3 infection 71

3.6. Autophagic flux is critical for the inhibition of CVB3 replication 75

3.7. Restoring of CVB3 inhibition through modulation of autophagic flux by compound C treatment in ATG5 KO HeLa cells 81

Chapter 4. Discussion 83

Reference 92

국문 초록 118

List of Tables

Table 2.1. Chemicals and media components used in the experiments 37

Table 2.2. Primary antibodies used in western blot analysis 41

Table 2.3. Secondary antibodies used in western blot analysis 42

List of Figures

Figure 1.1. Classification of the virus family Picornaviridae. Picornaviridae is one of the most genetically diverse families of positive-sense and single-stranded RNA viruses, classified into 29... 19

Figure 1.2. Genome organization of coxsackievirus B3 (CVB3) [3]. The CVB3 genome contains a single open reading frame (ORF) with highly structured untranslated regions (UTR) at the 5'-... 20

Figure 1.3. Structure of the coxsackievirus B3 (CVB3) capsid. (A) A schematic model of the icosahedral CVB3 capsid structure composed of 60 asymmetric units, each composed of one... 21

Figure 1.4. Schematic model of the three main types of autophagy described in mammalian cells. (A) Macroautophagy degrades soluble proteins, organelles, and protein aggregates upon their... 22

Figure 1.5. The process of macroautophagy. A portion of cytoplasm, including organelles, is enclosed by a phagophore or isolation membrane to form an autophagosome. The outer membrane... 23

Figure 2.1. Morphology of HeLa cells. HeLa cells were sub-cultured in the Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum and a 100 ㎍/ml... 26

Figure 2.2. Morphology of Vero cells. Vero cells were sub-cultured in Minimum Essential Medium α, no nucleosides medium supplemented with 5% fetal bovine serum and a 100 ㎍/ml... 27

Figure 2.3. Virus taxa infecting vertebrates. Viruses are broadly classified according to the type of nucleic acid (DNA viruses or RNA viruses), which are then further classified according to their... 30

Figure 2.4. Phylogenetic tree based on the complete genomes of coxsackievirus B3 (CVB3) strains from around the world. The tree was constructed using the maximum-likelihood method... 32

Figure 2.5. Cytopathic effect (CPE) observed in HeLa cells after coxsackievirus B3 (CVB3) infection. HeLa cells were infected with CVB3 at a multiplicity of infection (MOI) of 10⁻¹ for 24... 33

Figure 2.6. Cytopathic effect (CPE) observed in Vero cells after coxsackievirus B3 (CVB3) infection. Vero cells were infected with CVB3 at a multiplicity of infection (MOI) of 10⁻¹ for 24... 34

Figure 2.7. Schematic representation of the tandem mRFP-EGFP-LC3B reporter to monitor autophagic flux. (A) Representation of the reporter construct mRFP-EGFP-LC3B and the... 44

Figure 2.8. Plasmid map of ptfLC3. ptfLC3B plasmid encoding the monomeric red fluorescent protein (mRFP) and the enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused in tandem with light... 45

Figure 2.9. The molecular structures of Lysotracker red. Lysotracker red DND-99 is a fluorescent marker in the molecular structure of a conjugated multi aromatic ring containing a... 47

Figure 2.10. The molecular biology of autophagy. Activation of AMPK in response to low cellular energy status inhibits mTOR and activates ULK1 via phosphorylation. Coordinated activation of... 50

Figure 2.11. Schematic representation of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) genome editing system. The Cas9... 52

Figure 2.12. Schematic representation of virus quantification using the plaque assay. This assay is based on a microbiological method conducted in a plate. Specifically, a confluent monolayer of... 55

Figure 3.1. Monitoring of autophagic flux in starvation-induced HeLa cells by western blot. The expression levels of SQSTM1/p62 (p62) and LC3B (LC3BI and LC3BII) proteins were detected... 58

Figure 3.2. Monitoring of autophagic flux in HeLa cells infected with coxsackievirus B3 (CVB3) at a high multiplicity of infection (MOI) by western blot. The expression levels of SQSTM1/p62... 60

Figure 3.3. Evaluation of autophagic flux following chloroquine (CQ) treatment. (A) The expression levels of p62 and LC3B (LC3BI and LC3BII) proteins were detected by western blot... 61

Figure 3.4. Assessment of autophagic flux by different short-term stimuli conditions in HeLa cells stably expressing exogenous mRFP-EGFP-LC3B. HeLa cells stably expressing mRFP-EGFP-... 64

Figure 3.5. Assessment of autophagic flux by different long-term stimuli conditions in HeLa cells stably expressing exogenous mRFP-EGFP-LC3B. HeLa cells stably expressing mRFP-EGFP-... 66

Figure 3.6. Comparison of autophagic flux in autophagy-stimulated HeLa cells by fluorescence microscopy. HeLa cells treated with serum-deprivation, EBSS, 20 μM chloroquine (CQ), or... 67

Figure 3.7. Tracking of the Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway in starvation-induced HeLa cells by western blot. The expression levels of Akt/mTOR/p70S6K pathway related proteins (p-... 69

Figure 3.8. Tracking of the Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway in HeLa cells infected with coxsackievirus B3 (CVB3) at a high multiplicity of infection (MOI) by western blot. The... 70

Figure 3.9. Generation of ATG5 knockout (KO) HeLa cell lines. (A) DNA sequencing analysis revealed the presence of mutation in ATG5 KO HeLa cell lines. The black arrow indicates the... 73

Figure 3.10. Monitoring of autophagic flux in coxsackievirus B3 (CVB3) infected ATG5 knockout (KO) HeLa cells by western blot. (A) The expression levels of SQSTM1/p62 (p62),... 74

Figure 3.11. Assessment of cell viability of HeLa cells after treatment with autophagy modulating drugs. Cell viability was quantified using the water soluble tetrazolium salt assay in HeLa cells... 77

Figure 3.12. Evaluation of the antiviral activity of autophagy modulating drug on coxsackievirus B3 (CVB3) infected HeLa cells. HeLa cells infected with CVB3 at a multiplicity of infection of... 78

Figure 3.13. Effect of compound C (CC) on autophagic flux in coxsackievirus B3 (CVB3) infected HeLa cells stably expressing exogenous GFP-RFP-LC3B. HeLa cells stably expressing... 80

Figure 3.14. Restoring coxsackievirus B3 (CVB3) inhibitory effect by compound C (CC) in autophagy deficient ATG5 knockout (KO) cells. Wild type (WT) HeLa cells and ATG5 KO HeLa... 82

Figure 4.1. Schematic representation of the stages of autophagy and the regulation of autophagy by coxsackievirus B3 and compound C. Autophagy begins when a membrane known as the... 91

초록보기

 콕사키바이러스 B3 (coxsackievirus B3, CVB3)는 Picornaviridae 과의 Enterovirus 속에 속하는 약 7,400 개의 매우 적은 염기서열을 유전체로 지닌 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로서 확장성 심근 병증의 주요 원인 바이러스이다. CVB3 는 주로 경구 감염에 의해 인두, 소장관, 및 점막 등에서 바이러스의 복제가 일어나는 것으로 알려져 있다. CVB3 감염 시 임상적으로 환자의 15% 정도는 특이 증상 없이 심전도의 이상만 관찰되지만, 일부의 경우에는 감염이 진행됨에 따라 바이러스성 심근염을 일으키며 만성적인 심장 손상 또는 사망으로 이어질 수 있는 확장성 심근병증을 유발한다. CVB3 는 광범위한 표적 장기를 가지고 있어 무균성 수막염, 췌장염, 및 수족구병을 유발하는 다양한 사례가 보고되고 있다. 이처럼 CVB3 는 다양한 인체 질병의 원인이 될 수 있지만, 아직까지 CVB3 감염을 치료할 수 있는 FDA 승인 백신이나 항바이러스 약물은 없다.

생물 세포들이 스스로 복제되는데 비해 바이러스는 자신의 유전체를 복제하기 위해 숙주 세포 내의 복제 기계에 크게 의존한다. 이전 연구들에 따르면 CVB3 는 감염 동안 세포 내의 잘 보존된 이화과정 중 하나인 자가포식 기작을 탈취하여 CVB3 복제를 촉진한다고 보고되었다. 그러나 CVB3 감염에 의해 유도되고 활용되는 자가포식은 일치된 견해를 보이지 않고 여전히 많은 부분에서 논란의 여지가 있다. 따라서 본 연구에서는 유전자형 D 에 속하는 CVB3 감염이 고전적인 자가포식에 미치는 직접적인 영향을 확인하고, 이를 기반으로 인위적 조절에 의한 자가포식 경로의 변화가 CVB3 감염에 미치는 항바이러스 효과를 평가하였다.

자가포식 과정은 매우 역동적이기 때문에 우리는 세포에 인위적으로 영양 성분 결핍을 통해서 기아를 유도하고 이를 지표로 삼아 웨스턴 블롯 모니터링, mRFP-EGFP-LC3B 를 안정적으로 발현하는 세포주 생성, 내인성 LC3B 단백질 관찰, 산성 소기관 염색 등 다양한 분석법을 통해 CVB3 감염에 의한 자가포식 수준을 면밀하게 측정하였다. 그 결과 유전자형 D 에 속하는 CVB3 감염이 고전적인 자가포식 경로의 초기 단계인 자가포식 개시와 후기 단계인 완전한 자가포식 플럭스를 유도하지 않는다는 것을 확인하였다. 그리고 이와 함께 자가포식에 의한 분해를 촉진하는 역할을 하는 p62 단백질이 자가포식과는 무관하게 CVB3 감염에 의해 절단되는 것을 입증하였다.

우리는 추가적으로 자가포식 경로의 초기 단계인 자가포식 개시로 형성되는 자가포식소체가 CVB3 감염에 미치는 영향을 평가하기 위해서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 자가포식소체 형성에 관여하는 ATG5 유전자가 결손된 세포주를 제작하고 CVB3 을 감염시켰다. 그 결과, 흥미롭게도 자가포식소체가 형성되지 않는 세포에서 CVB3 감염은 억제되지 않고 오히려 증가하였다. 이러한 발견은 자가포식의 초기 단계에서 형성되는 자가포식소체가 유전자형 D 에 속하는 CVB3 감염에 필수적인 역할을 하지 않는다는 것을 입증한다.

또한, 서로 다른 기전의 3 가지 자가포식 조절제인 compound C, rapamycin, 및 chloroquine 를 각각 처리하여 CVB3 가 감염된 세포 내 자가포식 경로를 인위적으로 변화시킨 결과, 완전한 자가포식 플럭스를 유도하는 것으로 연구된 compound C 가 CVB3 감염을 억제하는 데 상당한 효과가 있음을 확인하였다.

종합하면, 본 연구는 HeLa 세포에 감염된 유전자형 D 에 속하는 CVB3 감염이 자가포식소체 형성과 라이소좀에 의해 분해되는 완전한 자가포식 플럭스를 유도하지 않으며, 고전적인 자가포식 경로와는 별개로 p62 단백질을 손상시킴으로써 완전한 자가포식 플럭스를 회피하는 것을 확인하였다. 또한 이를 기반으로 자가포식 플럭스를 유도하는 화합물인 compound C 처리를 통해서 CVB3 복제가 억제됨을 확인하였다. 따라서 바이러스의 복제에 유리하도록 CVB3 자체적으로 회피하는 경로에 대항하는 완전한 자가포식 플럭스의 유도는 CVB3 매개 질환의 치료 및 완전한 자가포식 플럭스를 회피하는 것으로 연구되고 있는 여러 바이러스의 질병 퇴치를 위한 잠재적 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다.

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