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Title Page 1

Abstracts 4

Contents 5

1. Introduction 9

2. Materials and methods 12

2.1. Media and culture conditions 12

2.2. Plasmid construction 13

2.3. Construction of S. cerevisiae recombinant strains 33

2.4. Construction of K. phaffii recombinant strains 34

2.5. Protein purification and quantification 35

2.6. Peroxidase activity assay for planthemoglobin 36

2.7. Precipitation of recombinant proteins by ammonium sulfate 37

3. Results 38

3.1. Secretory production of plant hemoglobins 38

3.2. Effect of hemin supplementation on planthemoglobin production 41

3.3. Plant hemoglobin precipitation using ammonium sulfate 53

3.4. Screening the signal peptide of production of plant hemoglobins 56

4. Discussion 65

5. Conclusions 67

References 68

국문초록 73

List of Tables 6

Table 1. Strams used in this study 14

Table 2. Plasmids used in this study 16

Table 3. Primers used in this study 19

Table 4. Plant hemoglobins sequence used in this study 21

Table 5. Signal peptides sequence used in this study 23

List of Figures 7

Figure 1. Schematic diagram of planthemoglobins expression in yeast 11

Figure 2. Gel electrophoresis results of backbone and insert fragments for construction of planthemoglobins expression plasmid in S. cerevisiae 24

Figure 3. Gel electrophoresis result of backbone and insert fragments for construction of planthemoglobins expression plasmid in K. phaffii 25

Figure 4. The plasmid map containing planthemoglobin expression cassette for S. cerevisiae 29

Figure 5. The plasmid map containing planthemoglobin expression cassette for K. phaffii 32

Figure 6. Quantification of planthemoglobins secreted by S. cerevisiae and K. phaffii with MF a signal peptide 39

Figure 7. Image-J analysis of the planthemoglobins content with MF a signal peptide 40

Figure 8. SDS-PAGE analysis of purified planthemoglobins secreted by recombinant S. cerevisiae with hemin supplementation 44

Figure 9. Image-J analysis of the planthemoglobins content in S. cerevisiae with hemin supplementation 45

Figure 10. Effect of hemin supplementation on planthemoglobins production in S. cerevisiae 46

Figure 11. SDS-PAGE analysis of purified planthemoglobins secreted by recombinant K. phaffii with hemin supplementation 49

Figure 12. Image-J analysis of the planthemoglobins content in K. phaffii with hemin supplementation 50

Figure 13. Effect of hemin supplementation on planthemoglobins production in K. phaffii 51

Figure 14. SDS-PAGE analysis of planthemoglobin concentrates using ammonium sulfate precipitation in S. cerevisiae 54

Figure 15. SDS-PAGE analysis of planthemoglobin concentrates using ammonium sulfate precipitation in K. phaffii 55

Figure 16. SDS-PAGE analysis of purified planthemoglobins secreted by recombinant S. cerevisiae with different signal peptides 58

Figure 17. Comparison of planthemoglobins production in S. cerevisiae with different signal peptides 59

Figure 18. Image-J analysis of the planthemoglobins content in S. cerevisiae with different signal peptides 60

Figure 19. SDS-PAGE analysis of purified planthemoglobin secreted by recombinant K. phaffii with different signal peptides 62

Figure 20. Comparison of planthemoglobins production in K. phaffii with different signal peptides 63

Figure 21. Image-J analysis of the planthemoglobins content in K. phaffii with different signal peptides 64

초록보기

 레그헤모글로빈은 식물 유래의 헤모글로빈으로 식물성 고기에 붉은색과 육즙을 제공하는 식품 첨가제로 활용될 수 있습니다. 그러나 기존의 콩과식물의 뿌리혹에서 레그헤모글로빈을 추출하는 방법은 수율이 낮고 비용이 많이 드는 문제를 가지고 있습니다. 이를 해결하기 위해서는 재조합 미생물을 이용한 정밀 발효를 통해 레그헤모글로빈의 지속적인 대규모 생산이 필요합니다. 따라서, 레그헤모글로빈을 포함하여 이와 구조가 비슷한 여러 식물 유래의 신규 헤모글로빈을 효모 균주인 Saccharomyces cerevisiae와 Komagatella phaffii를 이용하여 생산하였습니다. 본 연구에서는 단백질 분비 서열와 유도 발현 프로모터를 사용하여 식물 헤모글로빈을 효모에서 세포외 분비로 성공적으로 발현시켰습니다. 또한, 헴을 보충하여 단백질 발현 농도와 식물 헤모글로빈의 활성을 증가시키기 위하여 배지에 헤민을 첨가하여 배양하였습니다. 추가적으로 기존 효모의 분비서열을 진핵생물 유래 분비 서열로 교체하여 효모에서 높은 수준의 식물 헤모글로빈 분비 생산을 달성하였습니다. 분비된 식물 헤모글로빈은 His-Tag을 사용하여 정제되었고, 추가적으로 황산 암모늄을 이용한 침전을 통해 효모 배양액으로부터 식물 헤모글로빈을 농축하였습니다. 이러한 농축 방법은 His-Tag을 이용한 정제 방식과 비교하여 경제적이고 간단하며 대량생산 시 정제방법으로 사용할 수 있습니다.

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