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Title Page 1

Summary 4

Contents 5

1. Introduction 9

2. Materials and Methods 13

2.1. Plasmid and strain construction 13

2.2. Media and culture conditions 21

2.3. Fermentation condition 22

2.4. Extraction and quantitative analysis methods 23

3. Results 25

3.1. Construction of retinal producing strains 25

3.2. Production of retinal by engineered S. cerevisiae 37

3.3. Enhancement of mevalonate pathway for improved retinal production 38

3.4. Overproduction of retinal by Pdc-deficient S. cerevisiae 40

4. Discussion 47

5. Conclusion 50

References 51

국문초록 54

List of tables 7

Table 1. Strains used in this study 17

Table 2. Plasmids used in this study 18

Table 3. Primer sequences used in this study 19

Table 4. Target sequences of gRNA used for CRISPR/Cas9 in this study 20

Table 5. Gene sequences used in this study 28

Table 6. Summary of retinal production by the recombinant S. cerevisiae strains in batch fermentation containing 20 g/L glucose and 10% (v/v) dodecane 46

List of figures 8

Fig.1. Metabolic pathway of retinal production from glucose in engineered S. cerevisiae. The abbreviations of enzyme and metabolite names... 12

Fig.2. Gel electrophoresis of the DNA fragments used for plasmid construction 26

Fig.3. Gel electrophoresis of PCR products for confirmation of the constructed plasmids 27

Fig.4. Gel electrophoresis of colony PCR products for confirmation of the S. cerevisiae DET and S. cerevisiae SET 33

Fig.5. Gel electrophoresis of colony PCR products for confirmation of the S. cerevisiae D452-CON, D452-RE, and DET-RE 34

Fig.6. Gel electrophoresis of colony PCR products for confirmation of the S. cerevisiae S4H-CON, S4H-RE, and SET-RE 35

Fig.7. Gel electrophoresis of colony PCR products for confirmation of the S. cerevisiae SET-RI 36

Fig.8. Fermentation profiles of the S. cerevisiae D452-CON (A), D452-RE (B), and DET-RE (C) 39

Fig.9. Fermentation profiles of the At-deficient S. cerevisiae S4H-CON (A), S4H-RE (B), and SET-RE (C) 42

Fig.10. Fermentation profiles of the P-deficient S. cerevisiae SET-RI 43

Fig.11. The picture of the two-phase extraction system of the SET-RE (A) and S4H-CON (B) 44

Fig.12. (A) Summary of retinal titer and yield in the dodecane layer by recombinant S. cerevisiae strains (B) Investigation of extraction capacity for dodecane solvent with retinal concentrations of intracellular fraction, aqueous fermentation medium,... 45

초록보기

 레티노이드는 비타민 A와 그 유도체로 이루어진 그룹으로 레티놀, 레티날, 레티노인산을 포함하는 필수 미량 영양소이다. 레티노인산은 비타민 A의 비가역적 산화 형태로 주름과 탄력 저하와 같은 노화로부터 피부를 보호하는 레티노이드의 활성 형태이다. 그러나 레티노인산은 심각한 피부 자극을 유발하기 때문에 전문의약품으로 분류되어 화장품에 사용이 금지된다. 따라서 자극성이 거의 없는 레티놀이 주름 개선 기능성 화장품에 널리 사용되고 있다. 하지만, 레티놀은 피부에 흡수된 후에는 레티날을 거쳐 레티노인산으로 전환되어 피부에 작용하기 때문에 활성도가 높지 않다. 레티노인산의 바로 전단계인 레티날은 레티놀과 마찬가지로 자극성이 적고, 피부에 흡수된다면 더욱 빠르게 레티 노인산으로 전환되어 레티놀보다 신속한 피부 개선 효과를 나타낸다. 따라서 본 연구에서는 대사공학적으로 재설계된 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 발효를 통해 바이오 화장품 성분으로서 레티날을 과생산하고자 하였다. 먼저, 카로티노이드를 생합성하는 진핵 미생물 유래의 레티날 생합성 유전자들을 야생형 S. cerevisiae에 도입하였을 때, 소량의 레티날이 생성되었다. 이후 S. cerevisiae의 메발론산 경로에서 ERG10과 tHMG1 유전자의 과발현을 수행하였을 때, 레티날 생산이 증가되었으나, 고농도의 에탄올도 함께 생성되었다. 따라서 pyruvate decarboxylase (PDC) 유전자가 결실되어 에탄올을 생산하지 못하는 Pdc-deficient S. cerevisiae 균주를 모균주로 사용하였고, 그 결과 레티날 생성을 더욱 증가시킬 수 있었다. 마지막으로 ERG10과 tHMG1 유전자를 과발현한 Pdc-deficient S. cerevisiae 균주에 레티날 생합성 유전자를 도입하고 이상계 발효 추출법을 이용하였을 때, 117.4 mg/L로 가장 많은 양의 레티날을 유기용매 층에서 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 대사공학적으로 재설계된 S. cereivisae를 이용하여 에탄올의 생산 없이 레티날을 발효 및 이상계 추출법을 통해 성공적으로 생산하였다.

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