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Title Page 1

Contents 4

LIST OF ABBREVIAIONS 12

ABSTRACT 13

CHAPTER Ⅰ. A study on SLX4 as a new regulator of PLK1-Aurora A axis in the G2/M progression of the cell cycle 16

Ⅰ. INTRODUCTION 17

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 22

1. Cell lines and culture 22

2. Cell synchronization 22

3. Small Interfering RNAs (siRNAs) 23

4. Mutagenesis and cloning 24

5. Antibodies 24

6. Immunoprecipitation 25

7. Immunoblotting 25

8. Immunofluorescence and image quantification 26

9. Cell cycle Analysis 27

10. Drug sensitivity assay 28

Ⅲ. RESULTS 29

1. PLK1 phosphorylation is decreased upon SLX4 depletion during G2/M cell cycle 29

2. SLX4 interact with PLK1 and Aurora Kinase A 34

3. Establishment of research models 38

4. Cell cycle SLX4 mutants are crucial for PLK1 phosphorylation 43

5. SLX4 is involved to G2/M transition and entry of mitosis 46

6. Cell cycle related SLX4 function does not affect to DNA damage repair pathway 52

7. Deficient phenotypes of PLK1 and Aurora A are rescued by SLX4 complementation 56

8. Schematic illustration for SLX4 function in G2/M transition of the cell cycle 60

Ⅳ. DISCUSSION 62

CHAPTER Ⅱ. Discovery of SLX4 as a new factor of the Psoralen-induced ICL repair pathway 64

Ⅰ. INTRODUCTION 65

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 69

1. Cell culture and cell line establishment 69

2. Small Interfering RNAs (siRNAs) 69

3. Mutagenesis and cloning 70

4. Antibodies 70

5. Immunoprecipitation 71

6. Immunoblotting 72

7. Immunofluorescence and image quantification 73

8. Laser micro-irradiation and live cell imaging 73

9. Drug sensitivity assay 74

10. Clonogenic assay 75

11. Homologous recombination assay 75

12. Statistical analysis 75

Ⅲ. RESULTS 76

1. SLX4 and NEIL3 have additive effect for psoralen-induced Interstrand crosslink DNA repair pathway 76

2. SLX4 is associated with ZNF212, which is related to psoralen-induced ICL pathway 80

3. SLX4 and ZNF212 are important both MMC and PUVA damage repair pathways 85

4. ZNF212 regulates protein stability of SLX4 in normal state 88

5. SLX4 is downstream factor of ZNF212 and NEIL3 in the DNA damage repair pathway 94

6. SLX4 and ZNF212 are critical for repair of Homologous recombination 99

Ⅳ. DISCUSSION 105

V. REFERENCE 107

ABSTRACT IN KOREAN 110

List of Tables 11

Table 1. List of siRNA sequences used in Chapter I 23

Table 2. List of siRNA sequences used in Chapter II 70

List of Figures 9

CHAPTER Ⅰ. A study on SLX4 as a new regulator of PLK1-Aurora kinase A axis in the G2/M progression of the cell cycle 9

Figure 1. PLK1 phosphorylation is decreased upon SLX4 depletion during G2/M cell cycle 33

Figure 2. SLX4 interact with PLK1 and Aurora Kinase A 37

Figure 3. Establishment of research models 42

Figure 4. Cell cycle SLX4 mutants are crucial for PLK1 phosphorylation 45

Figure 5. SLX4 is involved to G2/M transition and entry of mitosis 51

Figure 6. Cell cycle related SLX4 function does not affect to DNA damage repair 55

Figure 7. Deficient phenotype of PLK1 and Aurora A are rescued by SLX4 complementation 59

Figure 8. Schematic illustration for SLX4 function in G2/M transition of the cell cycle 60

CHAPTER Ⅱ. Discovery of SLX4 as a new regulator of the Psoralen-induced ICL repair pathway 10

Figure 1. SLX4 and NEIL3 have additive effect for Psoralen-induced ICLs repair pathway 79

Figure 2. SLX4 is associated with ZNF212, which is related to psoralen-induced ICL pathway 83

Figure 3. SLX4 and ZNF212 are important both MMC and PUVA damage repair pathways 87

Figure 4. ZNF212 regulates protein stability of SLX4 in normal state 92

Figure 5. SLX4 is downstream factor of ZNF212 and NEIL3 in the DNA damage repair pathway 97

Figure 6. SLX4 and ZNF212 are critical for repair of Homologous recombination 103

초록보기

 엄격하게 조절되는 세포 주기는 정확한 세포 생존을 위해 필수적이다. 암세포는 과증식을 초래하는 불규칙한 세포 주기를 가지고 있으며, 따라서 이러한 암의 특성을 표적으로 하기 위해 다양한 세포 주기 키나제 억제제가 개발되어왔다. 본 연구에서는 세포 주기 G2/M 전환에서 SLX4와 PLK1의 생물학적 관련성을 조사했다. 이전 연구에 따르면 SLX4는 세포 주기 진행과 관련된 SLX4의 기능이 설명되지 않았지만 CDK1에 의해 인산화되고 PLK1과 상호 작용한다는 것이 밝혀졌다.

본 연구에서는 SLX4가 고갈된 세포가 특히 세포 주기의 G2/M 단계에서 인산화된 PLK1의 감소를 나타냄을 관찰했으며 흥미롭게도, SLX4의 고갈은 PLK1의 인산화에만 영향을 미치며, 알려진 PLK1의 상류 조절자인 오로라 키나제 A는 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀냈다. 또한, PLK1에 대한 SLX4-WT 및 SLX4 결합 및 오로라 키나제 A 결손 돌연변이를 안정적으로 발현하는 섬유아세포 세포주를 확립하였다. 또한, SLX4가 고갈된 세포는 지연된 세포 주기 진행을 보였는데, 이는 PLK1의 고갈과 동일한 결과로, 이러한 결과는 SLX4 세포주 모델에서도 입증되었다. SLX4 결합 결손 돌연변이 세포주는 PLK1의 인산화 및 세포 주기 진행 정도에 영향을 받음을 관찰하였다. 또한, DNA 복구 분석을 수행함으로써, 세포 주기와 관련된 SLX4 기능이 DNA 손상 복구 경로에는 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하였다. 또한, SLX4의 결합 결손 돌연변이가 G2/M 세포 주기 정지를 구제할 수는 없지만, SLX4가 PLK1 또는 오로라 키나제 A의 고갈에 의해 유도된 G2/M 정지를 구제한다는 것을 밝혔다.

결론적으로, 본 연구를 통해 SLX4는 세포 주기의 G2/M 전이에서 PLK1-오로라 축을 촉진하는 세포 주기 진행 기능을 가지고 있다는 것과 SLX4와 PLK1의 결합 영역은 PLK1 억제제의 표적이 될 수 있다는 가능성을 제시한다.

제 2장에서는, 가닥 간 DNA 손상 복구과정과 관련된 SLX4의 기능을 연구했다. 지금까지 SLX4 기능은 판코니 빈혈 경로에서 연구되었으며, 이는 가닥 간 가교(ICL)의 주요 복구 경로로 밝혀져 왔다. 또 다른 ICL 복구 경로로는 NIEL3 글리코실라제에 의해 복구되는 소라렌 유도 ICL 경로이다. TRAIP는 이 두 ICL 경로의 마스터 조절자로 보고되어왔다. SLX4는 소라렌 유도 ICL 병변에 모집될 수 있다는 것 또한 선행연구를 통해 보고되었다.

따라서, SLX4가 소라렌 유도 ICLs 경로에서 기능을 하는지 여부를 조사했다. 미토마이신 C와 소라렌 유도 ICL (PUVA) 복구 경로의 비교를 통해, SLX4가 PUVA에 의해 유도된 DNA 복구에 중요한 역할을 한다는 것을 확인했다. 또한, SLX4는 소라렌-ICL 복구 경로에 포함된 중요한 요소인 NIEL3 및 ZNF212와 상호 작용한다. 레이저 유도 미세 조사를 사용하여, ZNF212와 NIEL3가 SLX4의 DNA 손상 복구 경로에서 상류 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 또한, SLX4와 ZNF212는 최종 DNA 복구 경로인 상동 재조합 경로에서 중요한 역할을 한다는 것 또한 밝혀냈다. 종합하면, SLX4가 시스플라틴 유도 ICL 경로뿐만 아니라 소라렌 유도 ICL 복구 경로에도 중요한 단백질이라는 것을 밝혀냈다.

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