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Title Page 2

Contents 5

ABBREVIATIONS 11

ABSTRACT 13

Ⅰ. INTRODUCTION 15

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 22

Cell culture and cell lines 22

Cell viability assays 22

Growth competition assays 22

Lentivirus production 23

Cell line construction 23

Genome-scale CRISPRi and CRISPRa screening 23

Gene Ontology enrichment and visualization 24

Quantitative RT-PCR analysis 24

Western blot analysis 24

Public data analysis 25

Statistical analysis 25

Ⅲ. RESULTS 30

1. BRCA1/2 mutation status is not strongly correlated with the response of breast cancer cell lines to PARPis 30

2. Genome-wide CRISPRi/a screening identified genes that modulate the response of MDAMB231 cells to PARPis 37

2.1. Validation of genome-wide screening processes 37

2.2. DNA repair genes are involved in the response to olaparib 42

2.3. TP53BP1 and ABCC2 have consistent effects on the response to olaparib depending on their expression levels 49

3. Genome-wide CRISPRi screening identified genes that modulate the response to olaparib at three different doses 58

3.1. Validation of genome-wide screening processes 58

3.2. CRISPRi screen identified genes that regulate the response to olaparib in MDAMB468 cells 62

4. Integration of the results from the CRISPRi screening approaches revealed modulators of the response to olaparib 70

4.1. Pathway analysis identified DNA repair and mitochondrial translation as common mechanisms by which modulators affect the response to olaparib in both cell lines 70

4.2. Loss of MTOR expression reduces the response to olaparib 79

5. Mitochondrial proteins modulate sensitivity to PARPis by regulating PARP enzyme activity 90

5.1. Loss of OXPHOS is coupled with increased anaerobic glycolysis 90

5.2. Hypoxia induces resistance to olaparib 102

5.3. Loss of OXPHOS reduces olaparib sensitivity by increasing PARylation 106

Ⅳ. DISCCUSION 112

Ⅴ. REFERENCE 117

ABSTRACT IN KOREAN 126

List of Tables 8

Table 1. Reagent table 26

Table 2. qPCR primer sequences 28

Table 3. sgRNA sequences for validation experiments 29

Table 4. Breast cancer cell lines used to test the IC₅₀ of olaparib 34

Table 5. Genes having a consistent role in MDAMB231 CRISPRi/a screens 55

Table 6. Common Sensitive genes with FDR 〈 0.1 (17 Genes) 74

List of Figures 9

Figure 1. CRISPR interference (CRISPRi) and CRISPR activation (CRISPRa) systems for transcription repression and activation 21

Figure 2. Olaparib sensitivity and BRCA1/2 mutation status in TNBC cell lines 33

Figure 3. Correlation of BRCA1/2 mutation status and PARPi response 36

Figure 4. Schematic of genome-wide CRISPR/dCas9i/a screens 39

Figure 5. The quality control of measurements of CRISPRi/a screens in MDAMB231 cell line 41

Figure 6. Gene rank plots from CRISPRi/a screens 45

Figure 7. Normalized read count of each sgRNAs from CRISPRi screen 47

Figure 8. Normalized read count of each sgRNAs from CRISPRa screen 48

Figure 9. Common genes from CRISPRi/a screens 52

Figure 10. Normalized read count of each sgRNAs from CRISPRi/a screen 54

Figure 11. mRNA expression level of ABCC2 and ABCB1 in breast cancer 57

Figure 12. Schematic of genome-wide CRISPR/dCas9i screens at 3 different doses 59

Figure 13. The quality control of measurements of CRISPRi screens in MDAMB468 cell line 61

Figure 14. Gene rank plots from MDAMB468 CRISPRi screens 64

Figure 15. Normalized read count of each sgRNAs from CRISPRi screens 66

Figure 16. Integration of selected genes across 3 different dose of Olaparib exposures 68

Figure 17. Ten common genes in all three dose screens 69

Figure 18. Integrated analysis of sensitive genes 73

Figure 19. Integrated analysis of resistant genes 76

Figure 20. Evaluation of applicability of mitochondrial ribosomal proteins as biomarkers 78

Figure 21. Gene rank plots of MTOR and RPTOR from MDAMB468i screen 81

Figure 22. Loss of MTOR and RPTOR gene expression reduces olaparib response 83

Figure 23. Growth competition assay using MTOR knockdown MDAMB468 85

Figure 24. Correlation analysis of MTOR gene expression versus olaparib sensitivity 87

Figure 25. Correlation analysis of downstream effectors of MTOR gene expression versus olaparib sensitivity 89

Figure 26. Gene rank plots of MRPL9, HCCS and POLG2 from MDAMB468i screen 93

Figure 27. Loss of MRPL9 and HCCS gene expression reduces olaparib response 95

Figure 28. Loss of MRPL9 and HCCS gene expression decreased OCR 97

Figure 29. Loss of MRPL9 gene expression upregulates anaerobic glycolysis 99

Figure 30. Loss of HCCS gene expression upregulates anaerobic glycolysis 101

Figure 31. Hypoxia causes resistance to olaparib treatment 104

Figure 32. Hypoxia increases DNA repair efficiency 105

Figure 33. Hypoxia does not change the O-GlcNAcylation 109

Figure 34. Loss of OXPHOS upregulates PARylation levels 111

초록보기

 2005년 BRCA1/2 돌연변이와 Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 저해제 간의 합성치사(synthetic lethal) 관계가 밝혀 짐에 따라 현재 PARP 저해제는 BRCA1/2 돌연변이가 많은 난소암과 유방암, 전립선암 그리고 췌장암에서 항암치료 후 유지요법으로 사용되고 있는 약물이다. 하지만 실제 임상에서 모든 BRCA1/2 돌연변이 환자가 PARP 저해제에 반응성을 보이지는 않았으며, BRCA1/2 돌연변이가 없다 하더라도 반응성을 보이는 경우들이 있어 BRCA1/2 이외의 환자선별을 위한 생물학적 표지자에 대한 필요성이 제기되어왔다.

따라서 본 연구에서는 BRCA1/2 돌연변이가 없는 두가지 유방암 세포주에서 CRISPR-dCas9 interference 및 activation 시스템을 이용하여 유전자 발현을 조절함으로써 BRCA1/2 돌연변이 여부와 상관없이 약물반응성에 영향을 주는 조절자를 찾고자 하였다. 이전 연구들에서 밝혔듯이 DNA repair 과정에 관여하는 많은 유전자들이 PARP 저해제 반응성에 관여하는 것으로 확인되었으며, 특정 세포주와 상관없이 공통적인 약물 반응성 조절자로서 작용하는 것들은 PARP 저해제의 작용기전과 직접적으로 연관되는 DNA repair나 NAD⁺ metabolism과 관련된 것들이었다.

특이하게도 많은 미토콘드리아 단백질들이 그 발현이 저해될 경우, 세포내 산화적 인산화 과정이 감소되고 혐기적 해당과정에 대한 의존도가 높아지면서 PARP 저해제에 대한 반응성을 감소시키는 것으로 나타났다. 특히 해당과정에 대한 높은 의존도는 암의 주요 특징 중 하나인 Warburg effect 및 저산소 환경에서의 대사적 특징과도 연관되며, 이러한 대사적 특징은 PARP 효소의 활성을 높여 PARP 저해제의 작용을 방해하는 것으로 보인다.

본 연구는 기존에 제시된 DNA repair 관련 유전자 외에도 세포내 에너지대사에 따라 PARP 저해제에 대한 반응성이 달라짐을 BRCA1/2 돌연변이 여부와 상관없이 유전체수준에서 밝혀냈다. 또한 현재 임상에서 활용하고자 하는 MTOR 저해제에 대한 재평가의 필요성을 제시하였으며, 항암치료후 증가된 ABCC2가 olaparib에 대한 반응성을 감소시킬 수 있음을 보여주었다.

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