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Title Page 1

Contents 4

ABBREVIATIONS 13

ABSTRACT 15

Ⅰ. INTRODUCTION 19

1.1. Hepatocellular carcinoma 20

1.2. Microvascular invasion 23

1.3. Biomarker for microvascular invasion 27

1.4. Epigenetic biomarker for microvascular invasion 30

1.5. Long non-coding RNA 35

Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 39

2.1. Study design 40

2.2. Cell culture 40

2.3. RNA preparation and reverse transcription-PCR 41

2.4. High resolution melting 41

2.5. Construction of dCas9 expression plasmids 42

2.6. Construction of overexpression plasmids 42

2.7. VIM-AS1 knockdown using siRNA 43

2.8. Actinomycin D assay 44

2.9. Simultaneous fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence 44

2.10. Dual luciferase reporter assay 45

2.11. RNA immunoprecipitation and N6-Methyladenosine RNA immunoprecipitation 46

2.12. In vivo tumorigenesis assay 46

2.13. Hematoxylin and eosin, Sirus Red, Masson's Trichrome staining and Fluorescent immunohistochemistry 47

2.14. Protein extraction and immunoblotting 48

2.15. Transwell migration and invasion assays 48

2.16. Bisulfite-sequencing 49

2.17. Chromatin immunoprecipitation-sequencing and chromatin immunoprecipitation-qPCR 49

2.18. Survival analysis 50

2.19. ChIP sequancing analysis 51

2.20. RNA sequencing analysis 51

2.21. Statistical analyses 52

Ⅲ. RESULTS 60

3.1. Suppression of VIM-AS1 by clinically significant methylation of cg02746869 in hepatocellular carcinoma 61

3.2. Involvement of VIM-AS1 in the migration and invasion of liver cancer cells 76

3.3. The correlation between elevated EPHA3 and unfavorable HCC prognosis 89

3.4. The role of IGF2BP1 binding at the m6A sites of EPHA3 for maintaining EPHA3 mRNA 98

3.5. Preventing IGF2BP1 binding to EPHA3 mRNA by upregulated VIM-AS1 110

3.6. Regulation of cell adhesion by VIM-AS1/EPHA3 in HCC 115

3.7. Effects of VIM-AS1/EPHA3 regulome on in vivo tumor in development and microenvironment 120

Ⅳ. DISCUSSION 126

Ⅴ. CONCLUSION 132

Ⅵ. REFERENCES 135

ABSTRACT IN KOREAN 145

List of Tables 8

Table 1. List of oligonucleotides used in PCR 53

Table 2. List of oligonucleotides used in VIM-AS1 FISH 55

Table 3. List of oligonucleotides used in EPHA3 FISH 57

Table 4. List of antibodies used in this study 59

Table 5. List of 50 CpGs motif search result 75

Table 6. List of VIM-AS1 and IGF2BP1 binding positions 108

List of Figures 9

Figure 1. Different stages of fatty liver disease and its progression toward fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC) 22

Figure 2. Peripheral vascular invasion of hepatocellular carcinoma tissues 26

Figure 3. The effect of biomarkers on microvascular invasion of hepatocellular carcinoma 29

Figure 4. A brief view of DNA methylation in hepatocellular carcinoma 33

Figure 5. The modulation of gene expression by cytoplasmic long non-coding RNAs 38

Figure 6. Identification of 50 hypermethylated sites in HCC 64

Figure 7. Inverse correlation of cg02746869 methylation and VIM-AS1 expression in patient with liver cancer 66

Figure 8. Differential methylation and expression of VIM-AS1 in normal and HCC cells 68

Figure 9. Effects of targeted DNA methylation on cg02746869 using CRISPR-dCas9 DNMT3A 70

Figure 10. Effects of targeted DNA demethylation on cg02746869 using dCas9-TET1 71

Figure 11. Histone modification patterns at the 50 CpG sites 72

Figure 12. Histone modification profiling at cg02746869 74

Figure 13. Differential methylation and expression of VIM-AS1 in normal and HCC cells 79

Figure 14. VIM-AS1 involved in various biological pathways of liver cancer cells 82

Figure 15. Pathway analysis of downregulated differentially expressed genes affected by VIM-AS1 overexpression 83

Figure 16. Impact of VIM-AS1 overexpression on cell adhesion-related gene expression 84

Figure 17. Functional assays of VIM-AS1 modification on hepatocellular carcinoma cell migration and invasion 86

Figure 18. Effect of cg02746869 hypermethylation on cell migration and invasion 87

Figure 19. Effect of cg02746869 hypermethylation on cell migration and invasion 88

Figure 20. Regulation of EPHA3 mRNA expression by VIM-AS1 in liver cancer cell lines 93

Figure 21. mRNA stability and expression analysis of EPHA3 mRNA and protein according to VIM-AS1 overexpression 94

Figure 22. Functional assay of EPHA3 silencing on HCC cell migration and invasion 95

Figure 23. Analysis of VIM-AS1 and EPHA3 expression between HCC progression and prognosis 96

Figure 24. Binding of IGF2BP1 at the m6A sites of EPHA3 101

Figure 25. Characterization of protein interactions with EPHA3 and VIM-AS1 102

Figure 26. Effect of IGF2BP1 and IGF2BP2 knockdown on EPHA3 mRNA levels 104

Figure 27. Effect of IGF2BP1 knockdown on EPHA3 expression and comparative protein expression in different types of cancer 105

Figure 28. Predicted structure of VIM-AS1 107

Figure 29. Effect of IGF2BP1 knockdown on EPHA3 mRNA stability 109

Figure 30. VIM-AS1 overexpression influenced the binding of EPHA3 mRNA and IGF2BP1 111

Figure 31. VIM-AS1 knockdown influenced the binding of EPHA3 mRNA and IGF2BP 112

Figure 32. Subcellular localization of VIM-AS1 and EPHA3 with IGF2BP1 113

Figure 33. Network analysis of cell adhesion related genes co-regulated by VIM-AS1 and EPHA3 117

Figure 34. Single-Cell RNA-seq analysis of cell adhesion and migration associated genes in HCC 119

Figure 35. VIM-AS1 and EPHA3 affected tumor formation and altered the tumor microenvironment in vivo 122

Figure 36. VIM-AS1 and EPHA3 influenced tumor microenvironment associated with collagen deposition 124

Figure 37. VIM-AS1 and EPHA3 affected tumor microenvironment associated with CAFs and vessel formation 125

Figure 38. Overview of VIM-AS1 regulatory pathway and its effect on the progression of HCC 131

초록보기

 간암은 높은 사망률과 재발 빈도를 보이는 암으로, 환자의 약 1/3은 조기 종양 재발을 경험하며, 이는 환자 예후 평가의 중요한 요소이다. 이 중 혈관 침범은 수술 후 24개월 이내 조기 재발의 주요 원인으로, 혈관 침범을 보이는 환자의 치료 전략 선택은 매우 중요한 고려사항이다.

혈관 침범은 대형 혈관 침범과 미세혈관 침범으로 나뉘며, 최근 연구에 따르면 미세혈관 침범이 악성 종양 및 환자 예후와 연관성이 있다는 연구 결과가 있다. 종양의 크기와 분화 정도, HBV 감염 및 종양 캡슐의 상태와 AFP 수준이 미세혈관 침범의 위험 요소로 알려져 있다.

이 외에도 STIP1, FN1, PD-L1과 같은 바이오마커와 circAKT3, microRNA-125b, lncRNA MVIH와 같은 후성유전적 바이오 마커가 미세혈관 침범에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나, 신뢰할 수 있고 효과적인 예측 마커는 여전히 부족하다.

DNA 메틸화는 안정적인 후성유전학적 메커니즘으로, 공격적인 암의 발견과 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 현재까지의 미세혈관 침범과 관련된 DNA 메틸화 바이오 마커와 DNA 메틸화에 의해 조절되는 유전자 대한 연구는 부족하여, 이에 대한 연구가 필요하다. 본 연구는 간암 환자의 예후를 예측할 수 있는 DNA 메틸화 부위를 발굴하고, 해당 부위가 조절하는 유전자와 이들이 간세포암의 공격성에 기여하는 분자적 기전을 확인하고자 하였다.

본 연구에서는 암유전체 아틀라스(TCGA)와 암유전체 연구센터(CGRC) 에서 얻은 간암 환자 표본의 DNA 메틸롬 데이터를 분석하여 간암에서 과 메틸화되는 CpG 부위를 식별했다. 또한, 간세포암 환자의 예후와 유의미한 관련이 있는 메틸화 부위인 cg02746869로 인해, 정상 간 조직에 비해 간세포암 조직에서 긴 비코딩 RNA(lncRNA)인 VIM-AS1의 하향 조절로 이어진다는 것을 확인했다. 또한, VIM-AS1의 발현 감소는 간암 환자의 불량한 생존 결과와 유의미한 연관성이 있어 간암 환자의 예후 마커로서의 잠재력을 확인하였다.

이러한 긴 비코딩 RNA는 단백질 코딩 잠재력은 없지만, 유전자 발현과 복잡한 신호전달 경로에서 중추적인 조절자 역할을 한다. 따라서 긴 비코딩 RNA의 세포 내 분자 메커니즘을 확인하기 위하여, VIM-AS1이 과발현 되어있는 세포주를 활용하여 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 그 결과, 간세포암의 발암성 증가에 기여하는 EPHA3를 발견하였으며, VIM-AS1은 EPHA3 mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.

기전적으로 VIM-AS1은 RNA 결합 단백질인 IGF2BP1과의 상호작용을 통해 EPHA3의 mRNA 안정성을 감소시켰으며, 이는 IGF2BP1이 EPHA3 mRNA의 3'UTR 지역에 결합하여, EPHA3 mRNA의 안정성을 조절하는 기전을 밝혔다. 또한, 간세포암 세포주에서 VIM-AS1 과발현 시, EPHA3 mRNA 의 안정성과 단백질 발현이 감소하여 간암세포의 이동성과 침습성이 감소하였다.

또한, 생체 내 연구를 통해 VIM-AS1-EPHA3 축이 간세포암의 종양 성장과 미세환경을 조절하여, 세포 외 기질 구성 및 혈관 구조의 변화를 일으킨다는 것을 입증하여, VIM-AS1의 종양 억제 역할을 뒷받침 했다.

이러한 결과는 과메틸화된 cg02746869로 인한 VIM-AS1의 하향조절이 m6A 의존적인 방식으로 EPHA3 발현을 증가시켜, 간암 세포의 공격성을 촉진한다는 것을 시사한다. 이러한 연구 결과는 간세포암종에서 보다 효과적인 진단 및 치료 전략을 설계하는데 활용할 수 있는 후성유전학적 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하며, 암 치료에서 바이오 마커 및 분자적 표적으로서 VIM-AS1의 중요성을 밝혔다.

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