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Title Page 2

Abstract 5

Contents 7

Abbreviation 14

Introduction 17

PART I. The LKB1-TSSK1B axis inhibits tumor growth through YAP phosphorylation 21

Ⅰ. Introduction 22

Ⅱ. Aims of study 25

Ⅲ. Materials and methods 28

A. Cell culture and transfection 28

B. Virus production and infection 28

C. Western blotting and immunoprecipitation (IP) 28

D. Subcellular fractionation 29

E. Luciferase assay 29

F. Recombinant protein purification 29

G. In vitro kinase assay 30

H. Immunofluorescence staining 30

I. Mutagenesis 31

J. Generation of knockout cell lines 31

K. TA cloning 32

L. shRNA transduction 32

M. Sulforhodamine B (SRB) assay 32

N. Soft agar assay 33

O. Xenograft 33

P. Antibodies and Reagents 33

Q. RNA extraction and quantitative real-time polymerase chain reactions (qRT-PCR) 34

R. Statistical analysis 35

Ⅳ. Results 36

1. TSSK1B triggers phosphorylation of YAP, leading to the suppression of its transcriptional activity 36

2. Endogenous TSSK1B modulates YAP phosphorylation and target gene activation 39

3. Endogenous TSSK1B modulates YAP phosphorylation through the Hippo pathway stimulation 42

4. TSSK1B induces YAP phosphorylation through upregulation of LATS1/2 activity via MAP4K4/6/7- and MST1/2-dependent mechanism 45

5. LKB1, the upstream kinase of TSSK1B, induces TSSK1B phosphorylation and mediate subcellular localization 48

6. LKB1-mediated activation of TSSK1B induces phosphorylation of YAP and modifies its subcellular localization 52

7. TSSK1B phosphorylates YAP independent of AMPKa1/2 55

8. TSSK1B directly phosphorylates YAP at Ser94 to regulate its activity 58

9. TSSK1B suppresses tumorigenic potential of YAP without LATS1/2 dependency 61

Ⅴ. Discussion 66

PART Ⅱ. GPR54. signaling induces YAP activation through a positive feedback loop in breast cancer 69

Ⅰ. Introduction 70

Ⅱ. Aims of this study 73

Ⅲ. Materials and methods 77

A. Cell culture and transfection 77

B. Antibodies and Reagents 77

C. Virus production and transduction 78

D. Western blot and immunoprecipitation (IP) 78

E. In vitro kinase assay 78

F. Luciferase assay 79

G. RNA isolation and quantitative real-time polymerase chain reactions (qRT-PCR) 79

H. Immunofluorescence staining 80

I. Site-directed mutagenesis 80

J. Generation of knockout cell lines using CRISPR/Cas9 system 81

K. TA cloning 81

L. siRNA transfection 82

M. shRNA transduction 82

N. Sulforhodamine B (SRB) assay 82

O. Soft agar assay 83

P. Clonogenic assay 83

Q. Chromatin immunoprecipitation (ChIP-IP) 83

R. Invasion assay 84

S. Migration assay 85

T. Statistical analysis 85

Ⅳ. Results 86

1. GPR54 signaling enhances YAP-TEAD transcriptional activity 86

2. Wild-type of GPR54 signaling facilitating YAP activation 89

3. GPR54 signaling enhances YAP activity through Gaq/11 and RhoA activation 92

4. GPR54 signaling inhibits LATS1/2 kinase activity 97

5. GPR54 signaling has a positive feedback loop with the Hippo-YAP pathway 100

6. GPR54 signaling facilitates cancer progression through the Hippo-YAP pathway 104

7. Verteporfin and p234 antagonist regulate YAP activity via GPR54 signaling 107

8. Deletion of YAP attenuates oncogenic potentials by GPR54 signaling 110

Ⅴ. Discussion 113

Conclusion 116

Reference 118

국문요약 127

List of Tables 13

Table 1. CRISPR sgRNA sequence 31

Table 2. qRT-PCR primer sequences 34

Table 3. Primer sequences of qRT-PCR 79

Table 4. Primer sequences of ChIP-IP 84

List of Figures 11

Figure 1. Regulation of the Hippo signaling pathway 19

Figure 2. Functional roles of YAP/TAZ in cancer progression 20

Figure 3. YAP phosphorylation under energy stress 26

Figure 4. Activation and effects of AMPK in cellular energy management 27

Figure 5. TSSK1B inhibits the transcriptional activity of YAP through phosphorylation 38

Figure 6. Loss of TSSK1B decreases YAP phosphorylation and enhances YAP activity 41

Figure 7. Deletion of TSSK1B attenuates YAP phosphorylation induced by the Hippo... 44

Figure 8. TSSK1B regulates phosphorylation of YAP through the Hippo pathway 47

Figure 9. LKB1 is an upstream activator of TSSK1B 51

Figure 10. LKB1 activation by TSSK1B promotes YAP phosphorylation and alters... 54

Figure 11. TSSK1B induces YAP phosphorylation independently of AMPKa1/2 57

Figure 12. TSSK1B induces YAP phosphorylation at Ser94, and negatively affecting its... 60

Figure 13. TSSK1B suppresses anchorage-independent growth and inhibits tumor... 65

Figure 14. Regulation of the YAP/TAZ by distinct GPCR upstream pathway 74

Figure 15. KISS1 cleavage 76

Figure 16. GPR54 signaling reduces YAP phosphorylation and induces its... 88

Figure 17. GPR54 WT, not GPR54 R331X, enhances mRNA and protein levels of YAP-... 91

Figure 18. Gaq/11 protein and RhoA protein are involved in GPR54 signaling leading to... 95

Figure 19. GPR54 signaling inhibits LATS1/2, leading to the activation of YAP 99

Figure 20. YAP activation enhances expression of GPR54 and KISS1 with autocrine... 103

Figure 21. GPR54 signaling induces YAP/TAZ-dependent tumorigenesis 106

Figure 22. YAP activity modulates by verteporfin and p234 antagonist through GPR54... 109

Figure 23. YAP activation induces tumorigenesis via GPR54 signaling 112

초록보기

 히포 신호 전달 경로는 세포 증식, 조직의 크기 조절 및 세포 사멸 등을 조절하는 중요한 신호 전달 체계이다. 이 경로는 다양한 외부 및 내부 신호를 받아들여 YAP(Yes-associated protein) 및 TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)라는 전사 공동 활성제의 활성을 조절한다. 히포 경로가 활성화되면, MST1/2와 LATS1/2 키나제가 YAP과 TAZ를 인산화하여 세포질에 위치하도록 유지시키고, 이로 인해 이들 단백질이 핵으로 이동하지 못하여 세포의 성장과 분열을 촉진하는 관련 유전자의 발현 촉진을 억제한다. 반대로 히포 경로가 비활성화되면 YAP과 TAZ 가 활성화상태가 되어 핵으로 이동하여 TEAD와 결합하고 관련 유전자의 발현을 활성화한다. 이 경로의 이상 활성화 또는 억제는 암, 조직 과증식 및 기타 질병의 원인이 된다는 많은 연구가 보고되고 있으며, 히포 신호 전달 경로의 구성요소를 표적으로 하는 치료 전략이 암 치료 등에서 중요하게 연구되고 있다. 이에 본 논문에서는 YAP과 TAZ를 타겟으로 하여 히포 신호 전달 경로를 조절하는 기전에 대해서 밝히고자 하였다.

PART I 에서는 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제인 TSSK1B가 YAP 의 활성을 억제하는 두가지 경로를 밝혔다. 첫번째로 LKB1-TSSK1B axis 가 YAP 의 serine 94를 직접적으로 인산화 시킴으로써 YAP-TEAD 복합체 형성이 억제하고, 이에 따른 YAP-TEAD 타겟 유전자 발현을 억제되는 것을 규명하였다. 두번째는 TSSK1B-LATS1/2 axis를 통해 YAP 의 serine 127을 인산화 시킴으로 YAP 의 활성을 조절한다는 사실을 발견하였다. 결론적으로 이러한 YAP 의 인산화 조절을 통해 다양한 암에서의 TSSK1B 의 암 억제 역할에 대한 가능성을 시사하였다.

PART II 에서는 GPCR 중 하나인 GPR54 신호 전달 경로가 YAP 의 활성화 조절 기전을 밝히고자 하였다. GPR54 신호 전달 경로는 Gaq/11 단백질과 결합하여 RhoA를 활성화시키고, 이는 LATS1/2 억제로 이어진다. 억제된 LATS1/2는 YAP 의 핵 내 이동을 유도하여, YAP은 핵 내에서 전사 인자인 TEAD와 결합하고 YAP-TEAD 타겟 유전자 발현을 증가시켰다. 또한 이러한 GPR54 신호 전달 경로가 유방암 세포에서 YAP과 TAZ 의존적으로 세포 증식, 세포 이동과 암의 잠재력을 증가시킨다는 사실을 밝혔다. 이러한 결과는 GPR54 신호 전달 경로를 표적으로 하는 것이 유방암 치료에 효과적인 전략이 될 수 있음을 시사한다.

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