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Title Page 1

Abstract 5

Contents 7

List of Abbreviations 14

Part Ⅰ. Discovery of Novel KEAP1 Degrader 17

1.1. Introduction 18

1.2. Results and Discussions 21

1.2.1. Design of KEAPI-targeting PROTAC 21

1.2.2. Binding affinity measurement of synthesized compounds 22

1.2.3. KEAP1 degradation efficacy of PROTAC compounds 23

1.2.4. CRBN-mediated proteasome degradation of KEAP1 24

1.2.5. SD2267 promoted nuclear translocation of NRF2 and activated NRF2 target genes 27

1.2.6. SD2267 reduced acetaminophen induced ROS generation in mouse hepatocytes 28

1.2.7. In vivo pharmacokinetics profile of SD2267 in mice 31

1.2.8. Therapeutic effect of SD2267 in acetaminophen-induced hepatotoxic mouse model 33

1.3. Conclusion 36

1.4. Experimental Materials and Methods 39

1.4.1. General 39

1.4.2. Chemistry 39

1.4.3. Competitive binding assay 50

1.4.4. Cell lines 51

1.4.5. Generation of cereblon (CRBN) knockdown HepG2 cells 52

1.4.6. Primary mouse hepatocyte isolation and culture 52

1.4.7. In vitro ROS measurement 52

1.4.8. Mitochondrial ROS and mitochondrial membrane potential measurement 53

1.4.9. Nuclear fraction 53

1.4.10. Western blotting 53

1.4.11. Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis 54

1.4.12. Immunofluorescnece staining 54

1.4.13. In vivo experiments 55

1.5. References 59

1.6. Appendix (Part Ⅰ) 63

Part Ⅱ. Applicability of KEAP1 E3 Ligase to the PROTAC Platform 76

2.1. Introduction 77

2.2. Results and Discussions 79

2.2.1. Design and synthesis of KEAPl BRD4 PROTACs 79

2.2.2. Degradation of BRD4 by PROTAC compounds in LNCap cells 80

2.2.3. Inhibition of LNCaP cell proliferation 81

2.2.4. Down-regulation of BRD4 target gene expression 82

2.3. Conclusion 84

2.4. Experimental Materials and Method 85

2.4.1. Cell culture and reagents 85

2.4.2. Cell viability assay 85

2.4.3. Western blot analysis 85

2.4.4. Quantitative real-time-polymerase chain reaction (RT-qPCR) 85

2.4.5. Statistics 86

2.4.6. General 86

2.5. References 93

2.6. Appendix (Part Ⅱ) 96

Part Ⅲ. Design, Synthesis and Evaluation of JAK3 Degrader 101

3.1. Introduction 102

3.2. Results and Discussions 107

3.2.1. Design and synthesis of JAK3 PROTAC 107

3.2.2. Degradation efficacy of JAK3 by synthesized PROTAC compounds 108

3.3. Conclusion and Future Perspective 112

3.4. Experimental Materials and Methods 115

3.4.1. General 115

3.4.2. Chemistry 115

3.5. References 133

3.6. Appendix (PartⅢ) 136

국문초록 158

List of Tables 11

Table 1.1. FRET-based competitive assay of KEAP1 PROTACs. All measurements were performed in... 22

Table 1.2. Pharmacokinetic parameters of SD2267 following IP or PO administrations of SD-2267 (3 mg/kg) in...... 32

Table 3.1. List of globally approved JAK inhibitors 105

List of Figures 12

Figure 1.1. KEAPl/Nrf2 signaling pathway 19

Figure 1.2. Mechanism of action of PROTAC 20

Figure 1.3. Design of KEAP1-targeting PROTAC 21

Figure 1.4. In vitro KEAP1 degradation efficacy of PROTAC compounds 24

Figure 1.5. SD2267 degraded KEAPI through CRBN-mediated proteasomal degradation 26

Figure 1.6. SD2267 promoted nuclear translocation of NRF2 and activated NRF2 target genes 28

Figure 1.7. SD2267 reduced acetaminophen induced ROS generation in mouse hepatocytes 31

Figure 1.8. In vivo pharmacokinetics profile of SD2267 in mice 32

Figure 1.9. Therapeutic effect of SD2267 in acetaminophen-induced hepatotoxic mouse model 35

Figure 2.1. Structure of E3 ligase binders for PROTAC technology 78

Figure 2.2. Design of KEAPl BRD4 PROTAC 79

Figure 2.3. Degradation of BRD4 by PROTAC compounds in LNCap cells 80

Figure 2.4. Inhibition of LNCaP cell proliferation 81

Figure 2.5. Down-regulation of BRD4 target gene expression 82

Figure 3.1. JAK/STAT Signaling pathway 103

Figure 3.2. Selection and modifications in JAK3 binder 107

Figure 3.4. Degradation activity of PROTAC compounds 111

List of Schemes 13

Scheme 1.1. Synthesis of KEAP1-targeting PROTAC[내용없음] 13

Scheme 1.2. Synthesis of boronic acid pinacol ester[내용없음] 13

Scheme 1.3. Synthesis of cyclized sulfonamide intermediate[내용없음] 13

Scheme 1.4. Synthesis of linker augmented CRBN E3 ligase binder[내용없음] 13

Scheme 2.1. Synthesis of KEAPl BRD4 PROTAC[내용없음] 13

Scheme 2.2. Synthesis of linker augmented JQ[내용없음] 13

Scheme 3.1. Synthesis of JAK3 PROTAC[내용없음] 13

Scheme 10. Synthesis of CRBN or VHL E3 ligase binder with linker[내용없음] 13

초록보기

 내부 대사 또는 환경 독소로 인한 반응성 산소 종(ROS)에 노출되면 심혈관 질환, 신경 퇴행성 질환, 호흡기질환(COPD) 및 암과 같은 다양한 질병이 발생할 수 있는 유해한 산화 스트레스를 유발할 수 있다. 따라서 ROS로 매개되는 이러한 질병으로부터 보호하는 것이 중요한 측면이 되었다. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)는 이러한 산화 스트레스에 대한 세포 방어 시스템의 주요 조절자이며 그 기능은 Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)에 의해 부정적으로 조절된다. 따라서 KEAP1을 억제하여 Nrf2를 활성화하는 것이 산화 스트레스 관련 질병을 타겟팅하는 전략이 되었다. 여기서 우리는 KEAP1의 프로테아좀 분해를 유도하고 NRF2를 활성화시키는 cereblon (CRBN) 기반의 Proteolysis-Targeting Chimera(PROTAC) SD2267을 설계하고 합성했다. 또한, SD2267의 KEAP1 분해 효능은 MG132 (프로테아좀 분해 억제제)에는 감소했으나 chloroquine (자가포식 억제제)에는 감소하지 않아 SD2267에 의한 KEAP1 분해가 프로테아좀 분해 의존적이고 자가포식 비의존적임을 시사했다. KEAP1이 분해된 후 SD2267은 Nrf2의 핵 이동을 촉진하여 Nrf2 표적 유전자의 발현을 유도하고 acetaminophen (APAP)에 의해 유도된 ROS 축적을 억제했다. 생체 내 약물동태학 연구를 기반으로, APAP로 유도된 간 손상 마우스 모델에 SD2267을 IP로 1 또는 3 mg/kg 투여했다. 우리는 SD2267이 간 KEAP1을 분해하고 APAP로 유도된 간 손상을 억제하는 것을 관찰했다. 얻은 결과는 SD2267이 산화 스트레스와 관련된 간 질환 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.

또한, 우리는 KEAP1 E3 ligase 모집 PROTAC을 설계하고 합성하려고 했다. PROTAC 분자는 E3 ligase를 활용하여 ubiquitin-proteasome system (UPS)을 통해 특정 단백질을 타겟팅하고 분해하는 것으로 잘 알려져 있다. PROTAC의 세 가지 필수 구성 요소는 protein of interest (POI)에 대한 ligand, E3 ligase를 모집하는 binder, 이 두 요소를 연결하는 linker이다. 인간 신체에 존재하는 E3 ligase의 수가 비교적 많음에도 불구하고(〉600), VHL, CRBN, MDM2, cIAP1, DCAF15, RNF4, RNF114 등 소수만이 사용되었다. 따라서 광범위한 E3 ligase 모집자의 식별은 표적 단백질 분해(TPD) 전략을 발전시키는 데 중요하다. 따라서 우리는 선택적이고 강력한 KEAP1 소분자 억제제를 E3 ligase 모집자로 사용하는 KEAP1 binder PROTAC을 설계하는데 집중했다. 이를 유연한 알킬 링커를 통해 JQ1 (BRD4 억제제)과 연결했다. 우리 화합물 SD-2406은 성공적으로 KEAP1 E3 ligase를 모집하여 LNCaP 세포에서 BRD4 표적 단백질을 효과적으로 분해하여 KEAP1 E3 ligase의 촉매 활성을 밝혔다. 이는 PROTAC 기술 개발을 위한 E3 ligase 확장의 잠재력을 보여준다.

또한, 우리는 Janus kinase 3 (JAK3) 분해 PROTAC에 대한 연구를 진행했다. JAK는 세포 내 비수용체 tyrosine kinase 단백질로, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 네 가지 가족 구성원이 있다. JAK는 cytokine 또는 성장 인자에 반응하여 JAK/STAT signaling pathway를 통해 신호를 전달한다. 그들의 과발현은 알츠하이머병, 자가면역 질환 및 암과 같은 여러 질병과 관련이 있다. JAK/STAT의 병리학적 특성은 연구자가 JAK 타겟 약물을 개발하는 데 중요한 초점이 된다. JAK 단백질의 ATP 결합 포켓이 매우 보존되어 있어 선택적 JAK 억제제를 발견하는 것이 도전적이다. 이러한 잠재력을 가지고 있음에도 불구하고 현재까지 보고된 JAK 타겟 PROTAC은 아직까지 많이 개발되지 않았다. 여기서 우리는 POI ligand로 개조된 Roche binder, pomalidomide 유형 CRBN (4N 및 5N), VHL E3 ligase binder 및 POI ligand와 E3 ligase binder를 연결하는 유연한 알킬 체인 링커를 적용하여 JAK3 분해 PROTAC을 설계, 합성 및 평가했다. HEK293 세포주에서의 분해 활성은 SD-2549 및 SD-2823이 농도 의존적으로 JAK3을 분해되는 것을 확인할 수 있었다. 종합적으로, 우리 PROTAC 화합물 SD-2549 및 SD-2823은 JAK/STAT 병리와 관련된 질병 치료를 위한 선택적 JAK3 분해제 개발에 유력한 신약 후보가 될 수 있다.

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