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Title Page 2

Contents 5

Abstract 13

1. Introduction 16

2. Experimental material and methods 27

2-1. Methods 27

2-1-1. Cell culture 27

2-1-2. Western Blot analysis 27

2-1-3. Cytotoxicity assay (MTT assay) 28

2-1-4. Clonogenic assay 29

2-1-5. Flow cytometry analysis 29

2-1-6. Proteomics 30

2-1-7. Total RNA sequencing 31

2-1-8. Interaction analysis between proteins 32

2-1-9. Animal 32

2-1-10. Treatment in liver cancer cells-derived xenograft model 33

2-1-11. Immunohistochemistry (IHC) and Hematoxylin staining 33

2-1-12. Invasion assay 34

2-1-13. In vivo image 34

2-1-14. Statistical analysis 35

3. Results 36

3-1. Efficacy of targeting GPER in liver cancer model 36

3-1-1. Overall survival (OS) of liver cancer patients according to expression of GPER 36

3-1-2. Comparison of endogenous GPER expression in liver cancer cell lines 38

3-1-3. Cytotoxicity of GPER ligands in liver cancer cell lines 40

3-1-4. Inhibition of cell proliferation via GPER in SK-Hep1 cells 42

3-1-5. Cell cycle regulation through GPER in SK-Hep-1 cells 44

3-1-6. Suppression of G2-M phase-related protein though GPER 47

3-1-7. G1 stimulated p53, p21, and ERK protein 49

3-1-8. G1 reduced RNA expression levels of genes that related cell cycle via p53 51

3-1-9. Regulation of cell cycle-related proteins via GPER-p53 54

3-1-10. G1 inhibits tumor growth in liver cancer cell-derived xenograft model 57

3-1-11. Cell cycle-related factors in liver cancer xenograft model 60

3-1-12. Increase of GPER-related factors in liver cancer xenograft model 62

3-1-13. Analysis of p53 expression through tissue immunostaining 64

3-2. Antistatic ability through GPER signal transmission 66

3-2-1. Genes whose expression increased by G1 66

3-2-2. Increased intracellular protein expression due to G1 68

3-2-3. Common factors among RNA and proteins increased by G1 70

3-2-4. Impact of ADAMTS1 expression on survival time in liver cancer patients 72

3-2-5. ADAMTS1 level changes induced by G1 treatment 74

3-2-6. Changes in ADAMTS1 expression induced by GPER ligands 76

3-2-7. Effects of GPER ligands on ADAMTS1 expression 78

3-2-8. Inhibition of G1 invasion effect 80

3-2-9. Evaluation of cytotoxicity following ADAMTS-1 treatment 82

3-2-10. Increase E-cadherin level by ADAMTS1 in SK-Hep-1 cell 84

3-2-11. ADAMTS1 inhibits in SK-Hep-1 cells 86

3-2-12. Suppression of liver cancer metastasis via GPER in a xenograft model 88

3-2-13. Variations in Metastasis-Related Factors in Tumor Tissue 90

3-2-14. Expression of ADAMTS-1 following G1 treatment in tumor tissues and metastasized liver 92

3-3. Establishment of a spontaneous metastasis model and development of lipid biomarkers in the metastasis model 95

3-3-1. Various xenograft models depending on the transplantation site for cancer research 95

3-3-2. Differences in carcinogenicity among xenograft models depending on mouse strains 97

3-3-3. Pattern of distant metastasis according to injection in NSGA mice 99

3-3-4. Non-invasive monitoring in cancer progressive model of NSGA mice 101

3-3-5. Application of anticancer drugs to spontaneous metastatic cancer model through subcutaneous transplantation in NSGA mice 105

3-3-6. Lipid analysis in experimental and spontaneous metastatic cancer models 108

3-3-7. Lipid distribution in metastatic and normal tissue using MALDI-MSI 112

3-3-8. Lipid composition analysis in metastatic regions using MALDI-MS/MS 115

3-3-9. Identification of metastatic lipids in a spontaneous metastatic cancer model in NSGA mice 117

4. Discussion 119

5. Conclusion 130

6. References 132

초록 145

List of Tables 10

Table 1. Diagnosis stage ratio of liver cancer patients 21

Table 2. Immune system differences between mouse strains 23

Table 3. Different expression genes, related to cell cycle between G1 and control in... 52

Table 4. List of cell cycle-related proteins downregulated in cells treated with G1 55

Table 5. List of DEGs increased in cells treated with G1 67

Table 6. List of proteins increased in cells treated with G1 69

Table 7. Differences in establishment of xenograft models between mouse strains 98

Table 8. Ratio of metastatic lesions to normal tissue in molecular weight values 111

Table 9. Identification of mass derived from liver cancer metastatic lesions 116

List of Figures 10

Figure 1. Estimated crude cancer incidences (A) and mortality (B) by sex in Korea 17

Figure 2. 5-year relative survival by diagnosis stage in male (A) and female (B)... 20

Figure 3. Metastasis process in mouse model 25

Figure 4. Overall survival for GPER expression in liver cancer patients 37

Figure 5. Expression levels of the endogenous GPER in liver cancer cell lines 39

Figure 6. Comparison of cell viability for GPER agonist (G1) and antagonist... 41

Figure 7. Comparison of colony formation by G1 and G15 43

Figure 8. Cell cycle regulation by G1 and G15 45

Figure 9. Expression of cell cycle-related proteins through GPER 48

Figure 10. Change of protein expression in GPER signaling pathway by G1 50

Figure 11. Cell cycle-related genes downregulated upon G1 treatment at RNA... 53

Figure 12. Downregulated cell cycle-related proteins in cells treated with G1 56

Figure 13. Inhibition of tumor growth by GPER in liver cancer xenograft model 58

Figure 14. Cell cycle-related protein changes in tumor tissue in xenograft mouse... 61

Figure 15. GPER-related protein changes in tumor tissue in xenograft mouse... 63

Figure 16. p53 confirmation of SK-Hep-1 treated tumor 65

Figure 17. Venn diagram of RNA and proteins with increased expression in liver... 71

Figure 18. Overall survival rates for ADAMTS-1 expression in patients with liver... 73

Figure 19. Expression of ADAMTS-1 and related factors in SK-Hep-1 cells... 75

Figure 20. ADAMTS1 expression level by GPER ligands 77

Figure 21. GPER and ADAMTS1 related protein alteration by G1 and TA 79

Figure 22. Comparison of invasion effect by G1 and G15 81

Figure 23. Cytotoxicity evaluation by ADAMTS1 in SK-Hep-1 cells 83

Figure 24. Alteration of EMT marker protein expression by ADAMTS1 85

Figure 25. ADAMTS1 inhibits the invasive ability of SK-Hep-1 cells 87

Figure 26. Inhibition of metastatic legion formation by G1 89

Figure 27. Examination of EMT-related Factors in Tumor Tissue 91

Figure 28. ADAMTS1 expression in tumor edge and liver tissues 93

Figure 29. Classification of mouse model construction methods 96

Figure 30. Distant metastasis according to injection 100

Figure 31. Various monitoring methods in NSGA mouse spontaneous metastatic... 102

Figure 32. Inhibition of metastasis by sorafenib in spontaneous metastasis... 106

Figure 33. Schematic of lipid analysis and identification in metastatic liver cancer... 109

Figure 34. Comparison of molecular weight intensity of metastatic liver tissue 110

Figure 35. Image of metastatic lesion for identified molecular weight 113

Figure 36. Image of lipid distribution with higher intensity in metastatic legions 118

Figure 37. Mechanism of GPER-mediated cell cycle arrest and metastasis... 131

초록보기

 간암은 발병률(7위) 대비 사망률(2위)이 높은 암이다. 특히 남성에서 더 많이 발생하고 악성화되는 경향이 있다. 또한, 전이된 간암의 생존율은 매우 낮고, 전이암의 발병 비율은 전체 간암 환자의 30% 이상을 차지한다. 간암을 극복하기 위하여 여러 치료 방법들이 연구되고 있으나, 부작용과 전이에 관한 문제는 아직 해결해야 할 부분이다. 암 연구 개발을 위해 사용되고 있는 전임상 모델은 연구 목적에 따라 적절히 사용되어 왔지만, 실제 환자를 완벽하게 모방하기에 어려움이 있고, 특히 현재 이용되고 있는 전이암 이종이식 모델은 제약이 많았다. 이를 위하여, 본 연구에서는 3장으로 나누어 간암 연구를 진행하였다. 간암이 여성에서 덜 발병하는 이유 중 하나로 에스트로겐이 있으며, 이를 수용하는 수용체인 중 하나인 G protein coupled estrogen receptor (GPER)이 관련되어 있다. GPER은 세포막에 위치하며 세포 외부의 신호를 전달하는 역할을 하고, 다양한 신호 전달에 관여하여 염증, 암 등을 조절한다. 따라서, 본 연구 1, 2 장에서는 GPER을 이용하여 간암 세포주와 이종이식 마우스 모델을 이용하여 항증식 및 항전이에 대한 효능 평가를 하였고, 3장에서는 원발암과 전이암을 모두 평가할 수 있는 자발적 전이암 모델을 구축하였고, 전이암 이종이식 모델을 이용하여 전이 바이오 마커를 도출하였다.

1 장, GPER 작용제(G1)와 길항제(G15)에 대한 세포 독성 평가 시험은 MTT 분석 및 세포군락형성억제실험(Clonogenic assay)으로 확인하였다. GPER 작용제인 G1은 길항제인 G15보다 SK-Hep-1 세포의 세포 생존율을 억제시켰다. G1의 SK-Hep-1 세포의 세포 증식 억제 효과를 조사하기 위해 유세포 분석을 통하여 세포주기를 분석한 결과, G2-M기가 정지됨을 확인하였으며, 이에 관여하는 단백질의 발현을 조사한 결과 p53, p21 수준이 증가하였다. 또한, 유전자 시퀀싱 분석, 프로테오믹스를 통해 세포 주기 관련 인자의 유의한 감소를 확인하였다. SK-Hep-1 유래 이종이식 모델에서 G1으로 처리된 그룹에서 종양성장이유의하게 억제되었다. 종양 조직 내의 단백질 발현 분석에서 G1 투여로 인해 p53 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다.

2 장, RNA sequencing 및 프로테오믹스 분석을 통해 G1에 의해 유의하게 증가한 공통 인자 ADAMTS1가 도출되었다. ADAMTS1은 전이 및 침습을 조절하는 역할을 한다. 따라서, GPER ligand와 ADAMTS1을 이용하여 간암 전이 효과를 조사하였다. GPER ligands(G1, Tamoxifen) 및 ADAMTS1으로 처리된 SK-Hep-1 세포에서 세포증식 인자 마커인 PCNA 단백질 수준이 감소하였다. E-cadherin 단백질 수준은 ADAMTS1으로 처리된 SK-Hep-1 세포에서 증가하였다. SK-Hep-1 세포의 침습성을 분석한 결과, G1과 ADAMTS1 처리군은 대조군 보다 종양의 침습이 억제되었다. In vivo에서 G1를 투여 받은 그룹에서 간 전이를 억제시켰으며, 원발성 종양 조직내의 단백질 분석에서 E-cadherin 단백질 발현 증가, Vimentin 및 PCNA 단백질 발현이 유의하게 감소하였으며, ADAMTS1의 발현도 증가하였다.

3 장, 현재 전이암 연구에 이용되고 있는 이종이식 모델들의 원발암 평가불가, 제작의 어려움 등의 한계점이 있다. 이러한 한계점을 극복하기 위하여 중증면역결핍마우스 NSGA에 암 세포를 피하 이식하여 전이암 모델을 구축하였다. 구축한 전이암 모델(자발적 전이암 모델)은 실험적 전이암 모델보다 전이가 발생된 장기가 다양하였으며, 실시간 모니터링, PET-CT analysis가 가능하였다. 구축한 전이암 모델과 실험적 전이암 모델의 간 조직을 이용하여 MALDI-MS를 통해 지질 분포 분석을 하였다. 지질 분석을 통해 정상 조직 대비 전이 병변에서 강도가 높은 m/z는 스핑고마이엘린 [d18:0/16:1], 포스파티딜콜린 [32:0], 포스파티딜콜린 [31:1], 포스파티딜콜린 [31:0], 포스파티딜에탄올아민 [36:2]으로 식별되었다. 이는 실험적 전이암 모델과 자발적 전이암 모델이 동일하게 식별되었고, 이를 통해 해당 peak를 전이의 바이오마커로서 활용할 수 있다.

본 연구에서 평가된 GPER의 간암 항증식 및 항전이의 기전을 확인하였고, 이를 통해 GPER은 간암의 치료 타겟으로서 활용될 수 있을 것이다. 또한, 본 연구에서 구축한 전이암 평가 모델은 기존의 전이암 모델의 한계점을 개선함으로서 전이암 연구에 더욱 효과적으로 활용될 것으로 기대된다.

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